Белки-репортеры в гибридных белках. Белковая инженерия Получение и характеристика нового рекомбинантного одно доменного антитела, специфически связывающегося с TNF человека, но не блокирующего его биологическую активность

После рассмотрения способов получения сайт-специфических мутаций необходимо сделать лишь один шаг, чтобы оказаться лицом к лицу с бурно развивающимся направлением молекулярной генетики, называемым белковой инженерией. Действительно, разработка методов направленного мутагенеза дала возможность не только с высокой точностью модифицировать отдельные белки и изучать их структурно-функциональные взаимоотношения, но и конструировать новые белки, не существовавшие в природе. Впечатляющими результатами применения такого подхода являются гибридные белки, получаемые путем объединения фрагментов и функциональных доменов разных полипептидных цепей с использованием генно-инженерных методов.

Другое перспективное направление белковой инженерии – это конструирование биологически активных пептидов, обладающих фармакологической активностью.

Библиотеки пептидов и эпитопов

В живом организме большинство биологических процессов управляется посредством специфических белок-белковых или белково-нуклеиновых взаимодействий. К таким процессам относятся, например регуляция транскрипции генов под действием различных белковых факторов, взаимодействие белковых лигандов с рецепторами на поверхности клеток, а также специфическое связывание антигенов соответствующими антителами. Понимание молекулярных механизмов взаимодействия белковых лигандов с рецепторами имеет большое фундаментальное и прикладное значение. В частности, разработка новых лекарственных препаратов белковой природы обычно начинается с идентификации исходной последовательности аминокислот, обладающей требуемой биологической активностью (так называемая "основная" (lead) последовательность). Однако пептиды с основной последовательностью аминокислот могут обладать и нежелательными биологическими свойствами: низкой активностью, токсичностью, малой стабильностью в организме и т.п.

До появления библиотек пептидов улучшение их биологических свойств осуществляли путем последовательного синтеза большого числа аналогов и проверкой их биологической активности, что требовало больших затрат времени и средств. В последние годы появилась возможность с помощью автоматических синтезаторов создавать за короткое время тысячи различных пептидов. Разработанные методы направленного мутагенеза также позволили резко расширить число белков, получаемых одновременно и последовательно тестируемых на биологическую активность. Однако только недавно разработанные подходы к созданию библиотек пептидов привели к получению миллионов последовательностей аминокислот, требуемых для проведения эффективного скрининга с целью выявления среди них пептидов, максимально удовлетворяющих предъявляемым критериям. Такие библиотеки используются для исследования взаимодействия антител с антигенами, получения новых ингибиторов ферментов и антимикробных агентов, конструирования молекул, обладающих требуемой биологической активностью, или придания новых свойств белкам, например антителам.

По способам получения библиотеки пептидов разделяются на три группы. К первой группе можно отнести библиотеки, полученные с использованием химического синтеза пептидов, в которых индивидуальные пептиды иммобилизованы на микроносителях. При таком подходе после присоединения очередных аминокислот в индивидуальных реакционных смесях к пептидам, иммобилизованным на микроносителях, содержимое всех реакционных смесей объединяют и разделяют на новые порции, которые используют на следующей стадии присоединения новых аминокислотных остатков. После проведения ряда таких этапов оказываются синтезированными пептиды, содержащие последовательности использованных в синтезе аминокислот во всевозможных случайных сочетаниях.

Библиотеки пептидов, иммобилизованных на микроносителях, обладают существенным недостатком: они требуют при скрининге использования очищенных рецепторов, находящихся в растворимой форме. В то же время в большинстве случаев при биологических испытаниях, проводящихся для фундаментальных и фармакологических исследований, чаще всего находят применение рецепторы, ассоциированные с мембранами. По второму способу библиотеки пептидов получают с помощью твердофазного синтеза пептидов, при котором на каждой стадии химического присоединения очередной аминокислоты к растущим пептидным цепям используют эквимолярные смеси всех или некоторых аминокислот-предшественников. На конечной стадии синтеза проводят отделение пептидов от носителя, т.е. перевод их в растворимую форму. Третий подход к конструированию библиотек пептидов, к описанию которого мы сейчас переходим, стал реальным именно благодаря развитию методов генной инженерии. Он прекрасно иллюстрирует возможности таких методов и, несомненно, является крупным достижением в их применении. В этой связи рассмотрим более подробно результаты использования библиотек пептидов в исследовании эпитопов (антигенных детерминант) белков.

Генно-инженерная технология получения гибридных белков позволила разработать эффективный метод наработки коротких пептидов для анализа их биологической активности. Как и в случае клонотек генов, библиотеки пептидов, полученные генно-инженерными методами, представляют собой большой (часто исчерпывающий) набор коротких пептидов. Два недавно сделанных наблюдения позволяют рассматривать библиотеку пептидов одновременно и в качестве библиотеки эпитопов белков. Во-первых, короткие пептиды могут включать все основные остатки аминокислот, играющие главную роль во взаимодействии с антителами, и они в состоянии имитировать крупные антигенные детерминанты белков. Во-вторых, в большинстве случаев нековалентные связи, образуемые между немногими наиболее важными остатками аминокислот белковых лигандов и их рецепторами, вносят основной вклад в общую энергию взаимодействия лиганд–рецептор. С учетом этого любой пептид можно рассматривать как потенциальный лиганд, гаптен или часть антигенной детерминанты более крупных полипептидов, а любую библиотеку пептидов – как библиотеку эпитопов белков или потенциальных лигандов для соответствующих белковых рецепторов.

Рис. II.19. Схема экспрессии пептидных эпитопов на поверхности оболочки нитевидных колифагов

Пептидные эпитопы находятся в составе гибридных полипептидных цепей минорного белка pIII (а ) или основного белка pVIII вирусной оболочки (б ). Стрелки указывают положение кодирующих эпитопы олигонуклеотидных фрагментов в геноме бактериофага, а также положение самих эпитопов. В составе полипептида pIII (а ) показана только одна копия эпитопа (на самом деле их число достигает 4–5)

Библиотека пептидов, полученная в результате реализации третьего подхода, в современном виде представляет собой набор десятков или даже сотен миллионов коротких различающихся последовательностей аминокислот, которые экспрессированы на поверхности вирионов бактериофагов в составе их собственных структурных белков. Это становится возможным благодаря введению методами генной инженерии в геном бактериофагов гибридных рекомбинантных генов, кодирующих измененные структурные белки его вирионов. (Данный метод известен под названием фагового дисплея .) В результате экспрессии таких генов образуются гибридные белки, на N- или С-концах которых (см. ниже) присутствуют дополнительные последовательности аминокислот. В наиболее хорошо разработанной системе, позволяющей конструировать библиотеки пептидов генно-инженерными методами, используют небольшой нитевидный колифаг f1 и два его белка: основной и минорный белки оболочки pVIII и pIII. In vivo оба белка синтезируются в виде полипептидных цепей с короткими N-концевыми сигнальными последовательностями, которые отщепляются сигнальной пептидазой во время их созревания после переноса к внутренней части бактериальной мембраны. Зрелые белки встраиваются в оболочку бактериофага в процессе ее сборки. При этом белок pVIII образует основную оболочку бактериофага, тогда как четыре или пять молекул pIII ассоциированы с концевой частью вириона и обеспечивают взаимодействие вирусных частиц с половыми ворсинками клеток E. coli (рис. II.19). Генно-инженерными методами пептиды соединяют с белками – непосредственно с их N-концевыми последовательностями или на небольшом от них расстоянии. Концевые последовательности большинства белков являются более гибкими и, как правило, экспонируются на поверхности глобулы, что позволяет получать гибридные рекомбинантные белки без существенного нарушения их основных свойств, а также делает интегрируемые пептиды доступными для распознавания извне. Кроме того, в таком положении и пространственная структура самих пептидов испытывает меньшее влияние белка-носителя. В ходе экспериментов было установлено, что введение чужеродных пептидов в N-концевую часть белка pIII не оказывает существенного влияния на жизнеспособность и инфекционность фаговых частиц, тогда как соединение пептидов длиной >5 аминокислотных остатков с N-концевой частью белка pVIII нарушает сборку вирионов. Последнее затруднение можно преодолеть доставкой к месту сборки вирионов молекул белка pVIII дикого типа, синтез которых направляется соответствующим геном вируса-помощника. В этом случае оболочка бактериофага будет содержать как измененные белки pVIII, так и полипептиды дикого типа от вируса-помощника.

Рис. II.20. Схема конструирования рекомбинантного вирусного генома, содержащего вставки вырожденных олигонуклеотидов, для получения библиотеки эпитопов

Двухцепочечный олигонуклеотид (а ), содержащий вырожденные кодоны NNK и те же самые сайты рестрикции в составе линкеров, лигируют с ДНК вектора Fuse5 (б ), расщепленного рестриктазойSfi I, с образованием рекомбинантного генома (в ), который направляет синтез гибридного рекомбинантного белка (г ), содержащего на N-конце указанную аминокислотную последовательность

При конструировании библиотеки пептидов прежде всего синтезируют два комплементарных друг другу олигонуклеотида, которые после отжига образуют двухцепочечную молекулу, центральная часть которой кодирует собственно пептиды (рис. II.20,а ), а выступающие по концам одноцепочечные участки комплементарны "липким" концам вектора, получающимся под действием соответствующей рестриктазы (см. рис. II.20,б ).

Для кодирования аминокислот пептидов используют вырожденные кодоны вида NNK или NNS, которые включают все четыре нуклеотида (N) в первом и втором положениях, G или T (K), а также G или С (S) в третьем положении. При таком подходе информация о всех 20 аминокислотах и одном стоп-кодоне заключена в 32 различных кодонах NNK и NNS, а не в 64, как это имеет место в случае природного генетического кода.

В процессе синтеза вырожденных олигонуклеотидов, кодирующих исследуемые пептиды, на каждой стадии используют индивидуальные нуклеотиды для кодонов инвариантных аминокислот, фланкирующих вариабельный участок пептида, а также эквимолярные смеси нуклеотидов для участков, кодирующих случайные последовательности. Образовавшийся в итоге набор вырожденных олигонуклеотидов далее клонируют в виде одноцепочечных фрагментов в соответствующих сайтах гена белка оболочки бактериофага в составе фагового вектора или фазмиды. Альтернативно для такого набора олигонуклеотидов (химически или с помощью ПЦР) синтезируют комплементарные цепи с включением инозина в вариабельные участки, поскольку его остатки, как известно, спариваются с основаниями С и T матрицы, что облегчает образование правильных дуплексов между соответствующими олигонуклеотидами. Образующиеся двухцепочечные олигонуклеотиды в случае необходимости обрабатывают соответствующими рестриктазами и клонируют в фаговом векторе. Итоговые рекомбинантные молекулы (см. рис. II.20,в ) ДНК вводят в бактериальные клетки, получая ~10 9 трансформантов на 1 мг рекомбинантной ДНК, образовавшиеся фаговые частицы размножают в бактериях и после очистки исследуют на присутствие рекомбинантных пептидов (см. рис. II.20,г ), способных взаимодействовать с исследуемыми рецепторами в белках их вирионов.

Число индивидуальных фаговых клонов в библиотеке является определяющим для ее использования. К примеру, библиотека, заключающая в себе все возможные гексапептиды, должна содержать 64 млн (20 6) разных шестичленных аминокислотных последовательностей, кодируемых ~1 млрд (32 6) различных гексакодонов (32 – число кодонов, с помощью которых можно закодировать любую из 20 аминокислот предложенным выше способом, а именно с использованием кодонов NNK или NNS). Для решения такой задачи должны быть получены очень большие библиотеки, содержащие, по крайней мере, 2·10 8 – 3·10 8 индивидуальных, независимых клонов, а величина 10 9 в настоящее время является верхним пределом для числа индивидуальных клонов библиотеки, которую еще можно практически использовать.

Исходя из этого, можно заключить, что максимальная длина пептидов, включающих в себя все возможные сочетания 20 аминокислот, с которыми возможно работать с помощью библиотек пептидов, составляет 6 аминокислотных остатков. Тем не менее, следует иметь в виду, что библиотека 15-членных пептидов того же размера (2–3·10 8 клонов) будет содержать больше разнообразных гексапептидов, чем рассмотренная выше библиотека 6-членных пептидов. Кроме того, поскольку лишь ограниченное число аминокислотных остатков в пептиде действительно определяет его биологическую активность, библиотека 15-членных пептидов может оказаться представительнее библиотеки более коротких пептидов с тем же числом клонов.

Рис. II.21. Схема отбора фаговых частиц, обладающих требуемыми эпитопами

Показаны три рекомбинантных фаговых частицы, экспрессирующие разные эпитопы в составе pIII. Только эпитоп центральной фаговой частицы распознается молекулой биотинилированного антитела, иммобилизованного на чашке Петри с помощью стрептавидина и использованного для скрининга библиотеки

Для того чтобы выделить из библиотеки пептиды с искомой биологической активностью, применяют различные методы скрининга. В частности, для выделения пептидов, имитирующих определенные эпитопы, используют биотинилированные моноклональные антитела соответствующей специфичности, которые иммобилизуют на твердой подложке с помощью стрептавидина (рис. II.21). Фаговые частицы, экспрессирующие на своей поверхности соответствующие эпитопы, взаимодействуют с антителами и задерживаются подложкой, тогда как другие рекомбинантные фаговые частицы удаляются в процессе промывания. Задержанные на подложке фаговые частицы далее элюируют кислотой, индивидуальные клоны дополнительно размножают в бактериальных клетках и экспрессированные на них эпитопы исследуют по различным критериям. Наличие идентичных или сходных последовательностей нуклеотидов среди клонированных последовательностей свидетельствует о специфичности процесса очистки. Индивидуальные клоны затем охарактеризовывают другими, в частности иммуноферментными методами. На заключительной стадии исследования осуществляют синтез выделенных пептидов и их всестороннее изучение в очищенном состоянии.

В настоящее время имеются данные о некоторых работах, проведенных с использованием пептидных библиотек. В одном из таких исследований из библиотеки были выделены пептиды, последовательность аминокислот в которых резко отличалась от последовательности аминокислот истинного эпитопа исследуемого антигена. Тем не менее, такой пептид прочно связывался со специфическими антителами и конкурировал за связывание с природным антигеном. Это позволило сделать вывод о возможности существования мимотопов – коротких пептидов, имитирующих природные эпитопы, последовательности аминокислот которых существенно различаются между собой. Удалось установить канонические последовательности аминокислот пептидов, имитирующих эпитопы природных белков, а среди них идентифицировать аминокислотные остатки, играющие ключевую роль во взаимодействии антиген–антитело.

Одним из многообещающих приложений библиотек пептидов является идентификация пептидных лигандов, имитирующих "структурные" эпитопы, образующиеся на поверхности белковых глобул в результате сворачивания их полипептидных цепей, что сопровождается пространственным сближением аминокислотных остатков, расположенных в полипептидной цепи на значительном расстоянии друг от друга. С помощью пептидных библиотек возможна идентификация пептидных аналогов различных эпитопов небелковой природы. По-видимому, в ближайшем будущем возможно использование пептидных библиотек для получения новых лекарственных препаратов, создания диагностических средств и производства эффективных вакцин. В области конструирования новых лекарственных препаратов усилия исследователей могли бы быть направлены на создание пептидных лигандов, специфически взаимодействующих с рецепторами, представляющими медико-биологический интерес. Знание структуры таких лигандов позволило бы упростить получение на этой основе лекарственных препаратов небелковой природы.

Библиотеки пептидов и эпитопов найдут свое применение и в исследованиях механизмов гуморального иммунного ответа, а также заболеваний иммунной системы. В частности, большинство аутоиммунных заболеваний сопровождается образованием аутоантител против антигенов собственного организма. Эти антитела во многих случаях служат специфическими маркерами того или иного аутоиммунного заболевания. С использованием библиотеки эпитопов, в принципе, можно получить пептидные маркеры, с помощью которых было бы возможно следить за специфичностью аутоантител во время развития патологического процесса как в индивидуальном организме, так и в группе пациентов и, кроме того, определять специфичность аутоантител при заболеваниях неизвестной этиологии.

Библиотеки пептидов и эпитопов потенциально могут быть использованы также для скрининга иммунных сывороток с целью выявления пептидов, специфически взаимодействующих с защитными антителами. Такие пептиды будут имитировать антигенные детерминанты патогенных организмов и служить мишенями для защитных антител организма. Это позволит использовать подобные пептиды для вакцинации пациентов, у которых отсутствуют антитела против соответствующих патогенов. Изучение эпитопов с помощью библиотек пептидов является частным случаем одного из многочисленных направлений их использования в прикладных и фундаментальных исследованиях взаимодействия лигандов и рецепторов. Дальнейшее усовершенствование этого подхода должно способствовать созданию новых лекарственных препаратов на основе коротких пептидов и быть полезным в фундаментальных исследованиях механизмов белок-белковых взаимодействий.

Белковая инженерия (англ. Protein engineering) -- раздел биотехнологии, который занимается разработкой полезных или ценных белков. Это относительно новая дисциплина, которая направлена на исследование фолдинга белков и принципов модификации и создания белков.

Существуют две основные стратегии для белковой инженерии: направленная модификация белка и направленная эволюция. Эти методы не являются взаимоисключающими; исследователи часто применяют оба. В будущем, более детальное знание структуры и функции белков, а также достижения в области высоких технологий, может значительно расширить возможности белковой инженерии. В итоге, даже неприродные аминокислоты могут быть включены благодаря новому методу, который позволяет включать новые аминокислоты в генетический код .

Белковая инженерия зародилась на стыке физики и химии белка и генетической инженерии. Она решает задачу создания модифицированных или гибридных молекул белков с заданными характеристиками. Естественным путем реализации такой задачи является предсказание структуры гена, кодирующего измененный белок, осуществление его синтеза, клонирования и экспрессии в реципиентных клетках .

Первая контролируемая модификация белка была проведена в середине 60-х годов Кошландом и Бендером. Для замены гидроксильной группы на сульфгидрильную в активном центре протеазы -- субтилизина они применили метод химической модификации. Однако, как выяснилось, такой тиолсубтилизин не сохраняет протеазную активность.

Белок в химическом отношении представляет собой однотипную молекулу, которая является полиаминокислотной цепочкой или полимером. Составлен он из аминокислотных последовательностей 20 типов. Узнав строение белков, люди задались вопросом: можно ли спроектировать абсолютно новые аминокислотные последовательности, чтобы они выполняли нужные человеку функции гораздо лучше, чем обычные белки? Для данной идеи подошло название Белковая инженерия .

О такой инженерии стали задумываться ещё в 50-е годы XX столетия. Случилось это сразу же после расшифровки первых белковых аминокислотных последовательностей. Во многих лабораториях мира начали делать попытки дублировать природу и синтезировать химическим путём заданные абсолютно произвольно полиаминокислотные последовательности.

Больше всех в этом преуспел химик Б. Меррифилд. Этому американцу удалось разработать чрезвычайно эффективный метод синтеза полиаминокислотных цепей. За это Меррифилду в 1984 году присудили Нобелевскую премию по химии.

Рисунок 1. Схема функционирования белковой инженерии

Американец начал синтезировать короткие пептиды, включая гормоны. При этом построил автомат - «химического робота» - в задачу которого входило производит искусственные белки. Робот вызвал сенсацию в научных кругах. Однако скоро выяснилось, что его продукция не может конкурировать с тем, что производит природа.

Робот не мог в точности воспроизводить аминокислотные последовательности, то есть ошибался. Он синтезировал одну цепь с одной последовательностью, а другую уже с немного изменённой. В клетке же все молекулы одного белка идеально похожи друг на друга, то есть их последовательности абсолютно одинаковые.

Была и другая проблема. Даже те молекулы, которые робот синтезировал правильно, не принимали ту пространственную форму, которая необходима для функционирования фермента. Таким образом, попытка подменить природу обычными методами органической химии привела к весьма скромному успеху.

Учёным оставалось учиться у природы, выискивая нужные модификации белков. Тут дело в том, что в природе постоянно идут мутации, ведущие к изменению аминокислотных последовательностей белков. Если отобрать мутантов с необходимыми свойствами, более эффективно перерабатывающих тот или иной субстрат, то можно выделить из такого мутанта измененный фермент, благодаря которому клетка приобретает новые свойства. Но данный процесс занимает очень большой период времени.

Все изменилось тогда, когда появилась генная инженерия. Благодаря ей, стали создавать искусственные гены с любой последовательностью нуклеотидов. Эти гены встраивали в приготовленные молекулы-векторы и внедряли эти ДНК в бактерии или дрожжи. Там с искусственного гена снималась копия РНК. В результате этого вырабатывался нужный белок. Ошибки в его синтезе исключались. Главное, надо было подобрать нужную последовательность ДНК, а дальше уже ферментная система клетки сама безупречно делала своё дело. Таким образом, можно заключить, что генная инженерия открыла путь белковой инженерии в самой радикальной форме .

Стратегии белковой инженерии

Направленная модификация белка. При направленной модификации белка ученый использует детальное знание структуры и функции белка, чтобы внести нужные изменения. Как правило, этот метод имеет то преимущество, что он недорогой и технически несложный, так как техника сайт-направленного мутагенеза хорошо развита. Однако, его основным недостатком является то, что сведения о подробной структуре белка часто отсутствуют, и даже когда структура известна, может быть очень трудно предсказать влияние различных мутаций.

Программные алгоритмы модификации белка стремятся к выявлению новых аминокислотных последовательностей, которые требуют мало энергии для формирования предопределенной целевой структуры. В то время как последовательность, которая должно быть найдена, велика, наиболее сложным требованием для модификации белка является быстрый, но точный, способ для выявления и определения оптимальной последовательности, в отличие ее от аналогичных субоптимальных последовательностей .

Направленная эволюция. В направленной эволюции случайный мутагенез применяется к белку и селекция идет так, чтобы выбрать варианты, которые имеют определенные качества. Далее применяются еще раунды мутации и селекции. Этот метод имитирует естественную эволюцию и в целом позволяет получить превосходные результаты для направленной модификации.

Дополнительный метод, известный как ДНК-перетасовки, смешивает и выявляет части удачных вариантов для получения лучших результатов. Этот процесс имитирует рекомбинации, которые происходят естественно во время полового размножения. Преимуществом направленной эволюции является то, что она не требует предварительных знаний о структуре белка, да и не нужно, чтобы иметь возможность прогнозировать, какое влияние данная мутация будет иметь. В самом деле, результаты экспериментов направленной эволюции удивляют, поскольку желаемые изменения часто бывают вызваны мутациями, которые не должны были иметь такой эффект. Недостатком является то, что этот метод требует высокой пропускной способности, который не представляется возможным для всех белков. Большое количество рекомбинантной ДНК должно быть мутированным и необходимо провести скрининг продуктов на выявление желаемого качества. Огромное количество вариантов часто требует покупки робототехники для автоматизации процесса. Кроме того, не всегда легко провести скрининг на выявление всех интересующих качеств .

1.1 Понятие белковой инженерии. История развития

Рисунок 1. Схема функционирования белковой инженерии

Белковая инженерия

Технология белковой инженерии используется (часто - в сочетании с методом рекомбинантных ДНК) для улучшения свойств существующих белков (ферментов, антител, клеточных рецепторов) и создания новых, не существующих в природе протеинов...

Белковая инженерия

1. Заменив несколько аминокислотных остатков лизоцима бактериофага Т4 на цистеин получен фермент с большим числом дисульфидных связей, благодаря чему этот фермент сохранил свою активность при более высокой температуре. 2...

Вид и видообразование

Аристотель употреблял термин «вид» для характеристики сходных животных. После появления работ Д. Рея (1686) и особенно К. Линнея (1751-- 1762) понятие о виде прочно закрепляется в биологии в качестве основного...

Высшая нервная деятельность в зрелом возрасте

Работа головного мозга долгие годы оставалась для человечества нераскрытой тайной. Не только священнослужители, но и ученые, исповедовавшие идеализм, связывали все психические процессы в организме с загадочной душой...

Генетические алгоритмы в задаче оптимизации действительных параметров

То, что называется стандартным генетическим алгоритмом, было впервые подробно описано и исследовано в работе де Джонга...

Генная инженерия

Генная инженерия появилась благодаря работам многих исследователей в разных отраслях биохимии и молекулярной генетики. На протяжении многих лет главным классом макромолекул считали белки. Существовало даже предположение...

Использование генетической инженерии при лечении болезней и создании лекарственных средств

Генная инженерия появилась благодаря работам многих исследователей в разных отраслях биохимии и молекулярной генетики...

История генетики

После повсеместного распространения учения Ч. Дарвина одним из первых критиков, указавших на слабое место в теории, был шотландский исследователь Ф. Дженкинс. В 1867 г. он заметил, что в дарвиновской теории нет ясности в вопросе о том...

Концепции развития современных технологий и энергетики

Для облегчения физического труда еще с древних времен изобретались разнообразные приспособления, механизмы и машины, усиливающие механические возможности человека. Но лишь немногие механизмы помогали человеку выполнять работу...

Особенности клонирования

Породы кур и их современное распространение

Птицеводство в большинстве стран мира занимает ведущее положение среди других отраслей сельскохозяйственного производства, обеспечивая население высокоценными диетическими продуктами питания (яйцо, мясо, деликатесная жирная печень)...

Проблема существования человечества в свете теории Вернадского о ноосфере

На основе наблюдений природных явлений представление о том, что живые существа взаимодействует с внешней средой и влияет на ее изменение, возникло давно...

Цитогенетика как наука

Цитогенетика - это наука о материальных основах наследственности. Она изучает особенности строения, воспроизведения, рекомбинации, изменения и функционирования генетических структур клетки, их распределение в митозе...

Эволюция групп организмов

Эволюционная теория учение об общих закономерностях и движущих силах исторического развития живой природы. Цель этого учения: выявление закономерностей развития органического мира для последующего управления этим процессом...

БЕЛКОВАЯ ИНЖЕНЕРИЯ, направление молекулярной биологии и биоинженерии, в задачи которого входят целенаправленное изменение структуры природных белков и получение новых белков с заданными свойствами. Белковая инженерия возникла в начале 1980-х годов, когда были разработаны методы генетической инженерии, позволившие получать различные природные белки с помощью бактерий или дрожжей, а также определённым образом изменять структуру генов и, соответственно, аминокислотную последовательность (первичную структуру) кодируемых ими белков. Исходя из принципов организации белковых молекул, взаимосвязи структуры и функции белков, белковая инженерия создаёт научно обоснованную технологию направленного изменения их структуры. С помощью белковой инженерии удаётся повышать термостабильность белков, их устойчивость к денатурирующим воздействиям, органическим растворителям, изменять лигандсвязывающие свойства. Белковая инженерия позволяет путём замены аминокислот улучшать работу ферментов и их специфичность, изменять оптимальные значения pH, при которых работает фермент, исключать нежелательные побочные активности, устранять участки молекул, ингибирующие ферментативные реакции, повышать эффективность белковых лекарственных препаратов и так далее. Например, замена лишь одного остатка треонина на остаток аланина или пролина позволила в 50 раз повысить активность фермента тирозилтРНК-синтетазы, а благодаря замене 8 аминокислотных остатков так называемая термолизин-подобная протеаза из Bacillus stearothermophilus приобрела способность сохранять активность при 120 °С в течение нескольких часов. К белковой инженерии можно отнести также работы по направленному изменению свойств белков с помощью химических модификаций, например введение фотоактивируемых соединений, изменяющих свойства молекулы под действием света, соединений-меток, позволяющих отслеживать пути перемещения белка в клетке или направлять его к различным компонентам клетки, и тому подобное. Такие работы проводятся преимущественно на рекомбинантных белках, получаемых с помощью генно-инженерных методов.

В белковой инженерии можно выделить два направления: рациональный дизайн и направленная молекулярная эволюция белков. Первое подразумевает использование информации о структурно-функциональных отношениях в белках, получаемой с помощью физико-химических и биологических методов, а также компьютерного молекулярного моделирования, для того чтобы определить, какие именно изменения в первичной структуре должны привести к желаемому результату. Так, для повышения термостабильности белка необходимо определить его пространственную структуру, выявить «слабые» участки (например, аминокислоты, недостаточно сильно связанные со своим окружением), подобрать для них наилучшие варианты замен на другие аминокислоты с помощью молекулярного моделирования и оптимизации энергетических параметров молекулы; после этого подвергнуть мутации соответствующий ген, а затем получить и исследовать мутантный белок. Если этот белок не удовлетворяет заданным параметрам, проводят новый анализ и повторяют описанный цикл. Такой подход наиболее часто используется в случае конструирования искусственных белков (белков de novo) с заданными свойствами, когда на входе имеется новая аминокислотная последовательность, в основном или полностью заданная человеком, а на выходе - белковая молекула с желаемыми характеристиками. Пока, однако, таким образом удаётся получать только небольшие белки de novo с несложной пространственной структурой и вводить в них простые функциональные активности, например металлсвязывающие участки или короткие пептидные фрагменты, несущие какие-либо биологические функции.

При направленной молекулярной эволюции белков с помощью генно-инженерных методов получают большой набор различных мутантных генов целевого белка, которые затем экспрессируют специальным образом, в частности на поверхности фагов («фаговый дисплей») или в бактериальных клетках, с тем, чтобы сделать возможным отбор мутантов с лучшими характеристиками. С этой целью, например, гены нужного белка или его частей встраиваются в геном фага - в состав гена, кодирующего белок, расположенный на поверхности фаговой частицы. При этом каждый индивидуальный фаг несёт свой мутантный белок, обладающий определёнными свойствами, по которым делается отбор. Мутантные гены получают путём «перемешивания» набора генов сходных природных белков различных организмов, как правило, с помощью метода полимеразной цепной реакции, так что каждый получаемый мутантный белок может включать в себя фрагменты многих «родительских» белков. По сути, этот подход имитирует природную эволюцию белков, но только существенно более быстрыми темпами. Основная задача белкового инженера в данном случае заключается в разработке эффективной селектирующей системы, которая позволит отбирать лучшие мутантные варианты белков с нужными параметрами. В случае вышеупомянутой задачи — повысить термостабильность белка - отбор можно вести, например, путём выращивания клеток, содержащих мутантные гены, при повышенной температуре (при условии, что присутствие в клетке мутантного белка увеличивает её термическую устойчивость).

Оба названных направления белковой инженерии имеют одну цель и дополняют друг друга. Так, исследование получаемых с помощью методов молекулярной эволюции мутантных вариантов белков позволяет лучше понять структурно-функциональную организацию белковых молекул и использовать полученные знания для целенаправленного рационального дизайна новых белков. Дальнейшее развитие белковой инженерии даёт возможность решать многие практические задачи по улучшению природных и получению новых белков для нужд медицины, сельского хозяйства, биотехнологии. В будущем возможно создание белков, обладающих функциями, неизвестными в живой природе.

Лит.: Brannigan J.А., Wilkinson А.J. Protein engineering 20 years on // Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 2002. Vol. 3. № 12; Патрушев Л. И. Искусственные генетические системы. М., 2004. Т. 1: Генная и белковая инженерия.

480 руб. | 150 грн. | 7,5 долл. ", MOUSEOFF, FGCOLOR, "#FFFFCC",BGCOLOR, "#393939");" onMouseOut="return nd();"> Диссертация - 480 руб., доставка 10 минут , круглосуточно, без выходных и праздников

Ефимов Григорий Александрович. Новые генно-инженерные белки на основе рекомбинантных антител против TNF: диссертация... кандидата биологических наук: 03.01.03 / Ефимов Григорий Александрович;[Место защиты: Институт молекулярной биологии им.В.А.Энгельгарда РАН].- Москва, 2015.- 122 с.

Введение

Обзор литературы 9

1. История открытия tnf 9

2. Суперсемейство tnf 10

3. Структура системы tnfnfr 12

4. Функции tnf 15

5. Роль TNF в патогенезе ревматоидного артрита и других аутоиммунных заболеваний 16

6. Терапевтическая блокировка tnf 18

7. Побочные эффекты и ограничения антиnf терапии 23

8. Новые подходы и перспективы tnf блокировки 25

Материалы и методы исследования 29

1. Получение и характеристика нового верблюжьего одно доменного антитела к tnf человека 29

Экспрессия и очистка однодоменного антитела Vhh41 29

Оценка связывания антитела Vhh41 с TNF человека методом ИФА 30

Изучение взаимодействия Vhh41 и TNF человека методом поверхностного плазменного резонанса 31

Исследования способности Vhh41 блокировать TNF человека 31

2. Конструирование, получение и характеристика гибридных белков флуоресцентных сенсоров TNF 32

Конструирование генов, кодирующих сенсоры TNF. 32

Экспрессия и очистка флуоресцентных сенсоров TNF. 33

Анализ взаимодействия Vhh41-K с рекомбинантным TNF. 34

Исследование биологических свойств флуоресцентного сенсора Vhh41-KTNFin vitro и in vivo . З5

Изучение способности флуоресцентного сенсора связывать TNF in vivo 36

Прижизненное изучение экспрессии TNF с помощью полученного флуоресцентного сенсора...39

3. Получение и характеристика одноцепочечного АНТИNF антитела 40

Изучение мышиного моноклонального антитела F10 40

Конструирование и экспрессия одноцепочечного антитела ahT-4 41

Измерение биологической активности одноцепочечного антитела ahT-4 42

4. Получение и характеристика химерного антиnf антитела 43

5. Конструирование, получение и характеристика биспецифических антител А9 и МА9 43

Конструирование, экспрессия и очистка антител А9 и тА9 43 Взаимодействие антител А9 и тА9 с рекомбинантным TNF человека методом

поверхностного плазменного резонанса 44

Цитотоксический тест 45

Цитофлуориметрия 45

Оценка способности биспецифического антитела А9удерживать TNF человека на

поверхности макрофагов 45

6. Сравнительная оценка эффективности системной и селективной блокировки макрофагального TNF 46

Модель острой гепатотоксичности, индуцированной введением JIIJC/D-галактозамина 46

Результаты и обсуждение 48

1. Получение и характеристика нового рекомбинантного одно доменного антитела, специфически связывающегося с TNF человека, но не блокирующего его биологическую активность 50

Создание генетической конструкции, кодирующей рекомбинантное однодоменное антитело

Экспрессия и очистка рекомбинантного однодоменного антитела Vhh41 52

Анализ взаимодействия однодоменного антитела Vhh41 с TNF человека 53

Анализ способности антитела Vhh41 блокировать биологическую активность TNF человека.54

2. Конструирование, получение и характеристика молекулярных сенсоров TNF для прижизненного изучения экспрессии tnf на основе одно доменных рекомбинантных антител и красного флуоресцентного белка 56

Получение генетических конструкций, кодирующих флуоресцентный сенсор TNF Vhh41-Ku

контрольные гибридные белки 56

Экспрессия и очистка флуоресцентного сенсора TNF Vhh41-K. 57

Анализ взаимодействия флуоресцентного сенсора TNF Vhh41-К с рекомбинантным TNFмыши

и человека 58

Исследование биологических свойств флуоресцентного сенсора TNF Vhh41-Kin vitro и in vivo. 61

Изучение способности флуоресцентного сенсора связывать TNF in vivo 66

Прижизненное изучение экспрессии TNFс помощью полученного флуоресцентного сенсора... 69

3. Получение и характеристика рекомбинантного одноцепочечного антитела, блокирующего биологическую активность TNF 72

Измерение активности мышиного моноклонального антитела F10 72

Конструирование одноцепочечного антитела на базе вариабельных фрагментов легкой и

тяжелой цепей мышиного моноклонального антитела F 10 74

Измерение активности одноцепочечного антитела ahT-4 75

4. Разработка и анализ химерного антитела против TNF человека

Сравнение кинетики взаимодействий химерного антитела 13239 и инфликсимаба с

рекомбинантным TNF человека 77 Сравнение нейтрализующей активности химерного антитела 13239 с активностью

инфликсимаба in vitro 79

Анализ активности химерного антитела 13239 in vivo 80

5. Конструирование, получение и характеристика селективного б локатора tnf, производимого клетками моноцитарно-макрофагального ряда 82

Молекулярное клонирование, экспрессия и очистка биспецифических антител 82

Взаимодействие антител А9 и тА9 срекомбинантным TNF человека 86

Блокировка антителами А9 и тА9 TNF-зависимой цитотоксичности in vitro 87

Анализ связывания антител А9 и тА9 с поверхностью макрофагов через взаимодействие с

поверхностной молекулой F4/80 89

Удержание эндогенно продуцируемого TNF человека на поверхности макрофагов

биспецифическим антителом А9 93

6. Физиологически значимая селективная блокировка tnf, производимого клетками моноцитарно-макрофагального ряда in vivo 96

Сравнительная оценка эффективности направленной блокировки TNF, производимого клетками моноцитарно-макрофагалъного ряда, и системной блокировки TNF в модели острой

гепатотоксичности 96

Заключение 99

Список литературы 100

Роль TNF в патогенезе ревматоидного артрита и других аутоиммунных заболеваний

Первый опыт антицитокиновой терапии был осуществлен в 1985 г., когда мышам была введена поликлональная антиNF кроличья сыворотка, что предотвратило развитие у них летальной гепатотоксичности, индуцированной введением ЛПС . Аналогичные результаты были получены на обезьянах: павианы, которым вводилось моноклональное мышиное антитело против TNF человека, выжили, после внутривенной инъекции летальной дозы Е. coli [ 104].

Первый терапевтический блокатор TNF был разработан на основе высокоаффинного мышиного моноклонального антитела А2, полученного из мышей, иммунизированных TNF человека . Поскольку антитела других видов имеют существенные отличия в аминокислотной последовательности, они непригодны для долговременного терапевтического использования в людях. Поэтому методами генной инженерии мышиные константные домены тяжелой и легкой цепей были заменены на человеческие. Вариабельные участки, связывающие антиген, при этом остались неизмененными . Подобные антитела называются химерными. Впоследствии это первое терапевтическое антитело против TNF получило международное непатентованное название - инфликсимаб.

Одной из наиболее очевидных областей применения антиNF терапии было лечение сепсиса. Однако клинические исследования не показали значительных результатов , что, по всей видимости, связанно с тем, что к моменту развития клинической картины сепсиса необратимые сигнальные каскады уже запущены.

К этому моменту было накоплено уже много фактов, говорящих об участии TNF в патогенезе ревматоидного артрита, поэтому это заболевание было выбрано в качестве следующей потенциальной мишени для антиNF терапии. Пилотные исследования инфликсимаба в ревматоидном артрите дали многообещающие результаты , а дальнейшее рандомизированное двойное слепое исследование подтвердило эффективность антиNF терапии в терапии аутоиммунных заболеваний . Однако после повторных инъекций у некоторых пациентов вырабатывались антитела, специфичные к мышиным аминокислотным последовательностям в вариабельных доменах, что снижало эффективность терапии.

Двойное слепое рандомизированное исследование показало, что инфликсимаб обладает синергическим эффектом с небольшими дозами метотрексата -цитостатического препарата, использующегося для монотерапии РА. В сочетании эти два препарата обладают большей эффективностью, а иммуногенность инфликсимаба снижается . Последовавшие II/III фазы клинических испытаний привели к одобрению инфликсимаба для терапии РА .

Механизм действия инфликсимаба обусловлен, в основном, связыванием растворимого TNF в системном кровотоке и в местах локальной гиперэкспрессии (синовиальная полость при РА). Но, кроме того, инфликсимаб способен связываться с трансмембранной формой TNF и вызывать лизис клеток, несущих его на своей поверхности через механизм антитело-зависимой цитотоксичности .

АнтиNF терапия разрывает патологический сигнальный каскад и приводит к снижению воспалительной реакции, но, кроме того, она способна сбалансировать дисрегулированную иммунную систему. На фоне введения ингибиторов TNF сдвигается баланс Т-эффекторных и Т-регуляторных клеток .

АнтиNF терапия не является этиотропной терапией и теоретически должна применяться в течение всей жизни больного, однако в некоторых случаях удается добиться стойкой ремиссии, которая сохраняется и после отмены антиNF терапии .

Блокаторы TNF показали свою эффективность и при терапии других аутоиммунных и воспалительных заболеваний: было показано, что TNF играет значимую роль в патогенезе болезни Крона - он сверхэкспрессируется в воспаленных участках кишечника . Предварительные успехи в терапии болезни Крона, резистистентной к стандартной терапии, с помощью инфликсимаба позднее подтвердились в рандомизированных клинических испытаниях в результате чего инфликсимаб был одобрен для терапии и этого заболевания.

Патогенез анкилозирующего спондилита (болезни Бехтерева), еще одного хронического системного аутоиммунного заболевания с преимущественным поражением суставов, также обусловлен сверхэкспрессией TNF. Клинические испытания инфликсимаба оказались успешными и для этого заболевания . Кроме того, антиNF терапия показала высокую эффективность в лечении псориаза и псориатического артрита .

На сегодняшний момент инфликсимаб и другие блокаторы TNF утверждены в качестве терапевтических агентов для следующих аутоиммунных заболеваний: ревматоидный артрит, ювенильный идиопатический артрит, анкилозирующий спондилит, болезнь Крона, язвенный колит, псориаз, псориатический артрит. Кроме этого, антагонисты TNF показали положительные результаты в терапии саркоидоза , гранулематоза Вегенера , болезни Бехчета и других хронических заболеваний.

Указания на то, что TNF играет роль в патогенезе рассеянного склероза , были подтверждены экспериментами на лабораторных животных. Введение TNF усиливало симптоматику экспериментального аутоиммунного энцефаломиелита у крыс , а введение антиNF антитела предотвращало развитие этого заболевания .

Однако клинические исследования по терапии рассеянного склероза инфликсимабом и еще одним блокатором TNF - ленерцептом (растворимый TNFR1) не дали значимого клинического ответа . Более того, у некоторых пациентов

Модельное аутоиммунное заболевание, патогенез которого сходен с патогенезом множественного склероза. наблюдалось усиление клинических симптомов заболевания и увеличение клеточности и уровня иммуноглобулинов в спинномозговой жидкости, увеличение количества очагов при магнитно-резонансном исследовании .

Успех применения инфликсимаба дал толчок к созданию новых молекул, способных блокировать передачу сигнала через TNFR. Кроме того, мышиные последовательности в вариабельных доменах тяжелой и легкой цепи инфликсимаба вызывали у части пациентов продукцию вторичных антител, которые блокировали действие инфликсимаба и делали больных невосприимчивыми к терапии. Чтобы преодолеть это ограничение, был выбран путь создания ингибиторов с полностью человеческими аминокислотными последовательностями.

На сегодняшний день, кроме инфликсимаба, для клинического применения одобрены четыре антагониста TNF (см. Рис. 2):

Этанерцепт - рекомбинантный ингибитор TNF, сконструированный на основе растворимого TNFR2. В основу его разработки легли данные о том, что в организме человека присутствует растворимая форма второго рецептора TNF . «Слущиваемый» под действием металлопротеаз TNFR2 является дополнительным звеном регуляции активности TNF . Этанерцепт представляет собой димер внеклеточной части TNFR2, генетически слитый с Fc-фрагментом иммуноглобулина IgGl. Соединение с константным участком антитела существенно увеличивает период полужизни препарата в системном кровотоке за счет рециркуляции белка через FcRn рецептор . Нейтрализующая активность гибридного белка была продемонстрирована как в in vitro, так и в in vivo опытах , а позже подтверждена в клинических испытаниях на пациентах, страдающих ревматоидным артритом .

Однако при терапии воспалительных заболеваний кишечника этанерцепт, в отличии от инфликсимаба, не показал терапевтической эффективности . Экспериментальный блокатор TNF онерцепт, полученный на основе другого рецептора TNF - TNFR1 (р55), несмотря на обнадеживающие пилотные клинические исследования в рандомизированном плацебо-контролируемом двойном слепом исследовании, также не показал эффективности в терапии болезни Крона . Исследования in vitro, в котором изучались Т-лимфоциты из собственной пластинки слизистой больных, страдающих болезнью Крона, показали, что тогда как и инфликсимаб, и этанерцепт блокируют TNF, только инфликсимаб связывается с Т-клетками в очаге поражения и индуцирует в них апоптоз . Этим может объясняться различие эффективности блокаторов на основе антител и рекомбинантных рецепторов в воспалительных заболеваниях кишечника.

Изучение взаимодействия Vhh41 и TNF человека методом поверхностного плазменного резонанса

Генетическая конструкция, кодирующая биспецифическое антитело А9 была собрана ГЩР реакцией с 4 праймерами аналогичной, описанной выше для гена одноцепочечного антитела ahT-4. Получившаяся в результате последовательность состояла из: гена однодоменного антиNF антитела , затем последовательности, кодирующей линкер вида (Gly4Ser)3, и гена одноцепочечного анти-Р4/80 антитела (любезно предоставлен С.Гордоном и М.Стейси). Сайты узнавания рестриктаз Ncol и Xhol были включены в последовательность прямого и обратных праймеров соответственно. После рестрикции ПЦР продукта и клонирования его в экспрессионный вектор pET-28b (Novagen) последовательность, кодирующая полигексидиновую метку оказалась на 3 конце в той же рамке считывания. Для получения контрольного антитела шА9 мутантный ген анти-Г4/80 scFv, содержащий вместо CDR последовательностей глицин-сериновые вставки был синтезирован de-novo (Geneart, Германия) и клонирован вместо нативного гена анти-F4/80 (см. Рис. 31В).

Экспрессионные вектора, несущие вставки, кодирующие А9 и шА9 были использованы для трансформации клеток Е.coli штамма Rosetta2(DE3)pLysS (Novagen). Лучшие клоны продуценты были отобраны методом иммуноблотинга колоний с использованием никель-конъюгированной пероксидазы (Pierce, 15165). Бактериальные культуры наращивались в среде LB, содержащей 50 цг/мл карбенициллина (Sigma -С1389) и 50 цг/мл хлорамфеникола (Sigma - С1863) до логарифмической фазы, а затем экспрессия индуцировалась 0.2 мМ ИПТГ. Через 4 часа культуры подвергались центрифугированию при 3200 g в течение 30 мин. Осадки замораживались а затем ресуспензировась в лизирующем буфере (50 мМ TrisHCl, 300 MMNaCl, 5% глицерин, 0.5% детергента Triton Х-100, 10000 Ед/мл лизоцим, 10 мМ Р-меркаптоэтанол) а потом разрушались с помощью утразвукового гомогенизатора. Лизаты центрифугировались при 17000 g в течение 40 мин., супернатанты отбирали и фильтровали через фильтр с диаметром пор 0,22 цм. БиспецифическЫ антитела А9 и тА9 очищались из просветленных супернатантов на хроматографической колонке, содержащей агарозу, конъюгированную с Ni-нитрилоуксусной кислотой (Invitrogen R90115). Аффинную хроматографию проводили по протоколу производителя. Полученный элюат концентрировали, диализовали против фосфатно-солевого буфера, с последующей фильтрацией через фильтр 0.22 мкм. Концентрация белка в растворе измерялась с помощью реакции с 2,2 -бицинхониновой кислотой (набор PIERCE 23225) по протоколу фирмы производителя. Гомогенность полученного препарата была проверена методом электрофореза в 15% полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия с последующей окраской кумасси.

Взаимодействие антител А9 и тА9 с рекомбинантным TNF человека методом поверхностного плазмонного резонанса.

Сравнение аффинностей и кинетик взаимодействия антител А9 и шА9 с рекомбинантным TNF человека проводилось на приборе ProteOn XPR36 (Bio-Rad). В ходе измерения всех взаимодействий использовался фосфатно-солевой буфер, имеющий рН=7,4, в который был добавлен детергент Tween 20 до концентрации 0,005%, температура поверхности чипа составляла 25 С. Рекомбинантный TNF человека был экспрессирован в Е. coli по описанной ранее методике . Антитела А9 и тА9 в концентрации 50 нМ иммобилиз провались через амино-группу на поверхности биочипа с модифицированной альгинатной полимерной поверхностью (Bio-Rad 176-5011). Затем аналит (TNF человека) в пяти двукратно убывающих концентрациях (50 -3 нМ) наносились в пять параллельных каналов. В шестой канал вводился буфер, не содержащий антитела, для нормировки. Анализ полученных сенсограмм проводился в программе ProteOn Manager (Bio-Rad) с использованием модели Ленгмюра.

В экспериментах с перитонеальными макрофагами клетки перитонеальной полости выделялись из мышей дикого типа (C57BL/6) и сразу же окрашивались с использованием антител, коъюгированных с флуорохромами. Для получения костномозговых макрофагов костный мозг выделялся, после чего клетки культивировались в течение 10 дней в кондиционный среде (полученной на линии L929), затем клетки снимались с пластика ледяным фосфатным буфером.

Перед окрашиванием Fc-гамма рецептор блокировался, затем клетки инкубировались с антителами А9 или тА9 или буфером, после чего клетки отмывались и окрашивались одним из трех способов: 1) поликлональными кроличьими антителами к hTNF-VnH, затем со вторичными антителами к IgG кролика, конъюгированными с флуорохромом. 2) моноклональными мышиными антителами к гексагистидиновой последовательность (Novagen - 70796), затем со вторичными антителами к IgG мыши, конъюгированными с флуорохромом. 3) к клеткам добавлялся рекомбинантный TNF человека, а затем моноклональные антиNF антитела (Miltenyi Biotec - clone: сА2), меченные флуорохромом.

Кроме того клетки окрашивались анти-Р4/80 и анти-CD 1 lb антителами, конъюгированными с флуорохромами. Образцы анализировались либо на приборе F ACS Aria (BDBiosciences) или Guava EasyCyte 8HT (Millipore) а затем полученные данные обрабатывались с помощью программы FlowJo (Treestar Inc.).

Оценка способности биспецифического антитела А9 удерживать TNF человека на поверхности макрофагов.

Перитонеальные макрофаги из мышей, продуцирующих TNF человека, выделялись и рассаживались в количестве 100 тыс. клеток на лунку в 96-луночные культуральные планшеты. Клетки инкубировались в течение 2 ч при 37С, 5%СОг, после чего не прикрепившиеся клетки смывались теплым фосфатным буфером. Затем клетки икубировались в течение ночи при 37С, 5% СОг. После промывки 200 мкл теплой среды DMEM клетки инкубировались с антителами А9 в концентрации 2мкг/мл или со средой DMEM 30 минут при 37С. После еще одной промывки клетки стимулировались ЛПС (Sigma, L2630) в концентрации 100 нг/мл. Через 4 ч культуральные супернатанты собирались и концентрация TNF человека измерялась с помощью набора для ИФА (eBioscience, 88-7346) по протоколу производителя.

Костный мозг из мышей, продуцирующих TNF человека выделялся, после чего клетки культивировались в течение 10 дней в кондиционный среде (полученной на линии L929), затем клетки снимались с пластика ледяным фосфатным буфером. Количество живых клеток подсчитывалось и они рассаживались на 96 луночные планшеты в концентрации 50000 клеток/лунку. Затем к клеткам добавлялось 250 цМ антитела А9 или однодоменного антитела hTNF-VffH или пустая среда (DMEM). Клетки инкубировались с антителами в течение 30 мин. Затем лунки промывались фосфатно-солевым буфером. После этого продукция TNF стимулировалась ЛПС (Sigma - L2630) в концентрации 100 нг/мл. Через 4 часа супернатанты собирались, концентрация TNF в них измерялась с помощью цитотоксического теста на линии мышиной фибросаркомы L929 по протоколу аналогичному описанному выше.

Исследование биологических свойств флуоресцентного сенсора Vhh41-KTNFin vitro и in vivo

На основании экспериментальных данных, полученных на линиях мышей, в которых ген Tnf удален в отдельных клеточных популяциях , была сформулирована гипотеза о возможных различных функциях TNF, производимого разными типами иммуноцитов. Так недавно было показано, что в модели экспериментальной туберкулезной инфекции TNF, продуцируемый Т-лимфоцитами, но не миелоидными клетками, имеет уникальную защитную функцию . Кроме того в нашей лаборатории получены данные, указывающие на патогенные свойства TNF из миелоидных клеток при аутоиммунных заболеваниях . Терапевтически применяемая полная блокировка ПМБне учитывает этих особенностей. В рамках развития данной гипотезы было выбрано специфическое ингибирование TNF, производимого клетками моноцитарно-макрофагального ряда, которое могло бы иметь существенное преимущество перед системной блокировкой этого цитокина. В частности, интактный сигнал от TNF, производимого В- и Т- лимфоцитами, мог бы снизить частоту побочных эффектов, а, кроме того, сделать антиNF терапию эффективной в тех болезнях, для которых ранее блокаторы TNF не показали клинической эффективности, или даже вызывали усиление симптоматики. Кроме того, такой подход может потенциально снизить необходимую дозу за счет адресной доставки к клеткам-продуцентам.

Для проверки этого предположения мы сконструировали и испытали биспецифическое антитело, которое одной своей частью связывается с поверхностью макрофагов за счет взаимодейсвия с трансмембранной молекулой F4/80, а второй специфичностью захватывает и блокирует производимый ими TNF.

Молекулярное клонирование, экспрессия и очистка биспецифических антител. Биспецифическое антитело - селективный блокатор макрофагального TNF -получило название А9. Для создания кодирующей его генетической конструкции были использованы однодоменное блокирующего антиNF антитело hTNF-VffH и одноцепочечное антитело (scFv) против макрофагального поверхностного маркера F4/80 (любезно предоставленное С. Гордоном (Оксфордский университет, Великобритания) и М. Стейси (университет Лидса, Великобритания). Последовательности, кодирующие оба антитела были амплифицированы с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) и клонированы в экспрессионный вектор таким образом, что они оказались в одной рамке считывания, а между ними образовалась нуклеотидная последовательность, кодирующая гибкий глицин-сериновый линкер (GSGGGGSG). На С-конце последовательности располагается последовательность, кодирующая гистидиновый гексамер, для последующей очистки белка (Рис. 31).

Дизайн биспецифического антитела А9, схематическое изображение его механизма действия, строение генетических конструкций, кодирующих биспецифическое антитело А9 и контрольный системный блокатор TNF -антитело тА9. (А) Биспецифическое антитело А9 состоит из однодоменного антитела (VHH) против TNF человека и одноцепочечного антитела (scFv) против поверхностной молекулы F4/80, экспрессирующейся на моноцитах и макрофагах. (Б) Принцип селективной блокировки TNF, производимого макрофагами: А9 связывется с поверхностью макрофагагов и захватывает высвобождаемый с их поверхности TNF, предотвращая его попадание в системную циркуляцию. (В) Схема генетической конструкции биспецифического антитела А9 и контрольного системного блокатора TNF - тА9. Ген однодоменного антиNF антитела сопровождается последовательностью, кодирующей гибкий глицин-сериновый линкер, а затем геном одноцепочечного антитела против F4/80. Затем следует последовательность, кодирующая гистидиновый гексамер для аффинной очистки. Контрольное антитело тА9 имеет аналогичную последовательность за исключением того, что 6 гипевариабельных участков анти-Р4/80 антитела заменены на последовательности вида (Gly3Ser)n, что препятствует связыванию антитела с поверхностью макрофагов и превращает его в системный ингибитор TNF.

Для изучения эффектов специфической блокировки TNF, производимого макрофагами, был необходим контрольный системный блокатор. Чтобы избежать эффектов связанных с различиями в аффинности антител, было решено использовать блокатор имеющий аналогичный А9 TNF-связывающий участок. А для того, чтобы исключить влияние других факторов, в частности изоэлектрической точки и молекулярной массы, которая может влиять на время полувыведения, контрольное антитело должно быть максимально приближено по первичной аминокислотной последовательности к изучаемому. Поэтому нами было сконструировано контрольное антитело - тА9, имеющее ту же структуру и аминокислотную последовательность, что и А9 за исключением того, что 6 его гипервариабельных участков в анти-Р4/80 scFv заменены на последовательности вида (Gly3Ser)n, той же длины, что исходные CDR участки (см. Рис. 31 В).

Оба антитела были экспрессированы в бактериальной системе и очищены методом аффинной хроматографии.

Размер антитела А9, определенный по электрофоретической подвижности и по данным ВЖЕХ, соответствовал расчетной молекулярной массе - 45 кДА (Рис. 32). хроматографии. Слева - значения молекуляного веса белков. (Б) Хроматограмма биспецифического антитела А9 (отмечена красным цветом), наложенная на хроматограмму маркеров молекулярной массы. (В) Функция зависимости времени прохождения молекулы в зависимости от молекулярной массы. Расчетная молекулярная масса биспецифического антитела А9 составила 43,4 кДа.

Взаимодействие антител А9 и тА9 с рекомбинантным TNF человека. Кинетика взаимодействия антител А9 и тА9 с рекомбинантным TNF человека измерялась методом поверхностного-плазмонного резонанса. Для этого оба антитела в концентрации 50 нМ были иммобилизованы на поверхности сенсорного чипа, после чего рекомбинантный TNF человека в серийных разведениях 50-3 нМ был нанесен в качестве аналита, а кинетика взаимодействия измерялась на приборе ProteOn XPR36. Оба антитела показали высокую аффинность: Kd А9 и тА9 составила 85 и 95 пМ соответственно. Это подтверждает, что внесенные мутации не повлияли на связывание с TNF. Кроме того оба антитела обладали сходными параметрами скорости связывания (Kforward, on-rate) и скорости диссоциации (Kreverse, off-rate) - приведены на Рис. 33 и в Таб. 3. Малая скорость диссоциации должна позволить антителу А9 удерживать связанный TNF.

Получение и характеристика нового рекомбинантного одно доменного антитела, специфически связывающегося с TNF человека, но не блокирующего его биологическую активность

Кинетика взаимодействия антител А9 и тА9 с рекомбинантным TNF человека измерялась методом поверхностного-плазмонного резонанса. Для этого оба антитела в концентрации 50 нМ были иммобилизованы на поверхности сенсорного чипа, после чего рекомбинантный TNF человека в серийных разведениях 50-3 нМ был нанесен в качестве аналита, а кинетика взаимодействия измерялась на приборе ProteOn XPR36. Оба антитела показали высокую аффинность: Kd А9 и тА9 составила 85 и 95 пМ соответственно. Это подтверждает, что внесенные мутации не повлияли на связывание с TNF. Кроме того оба антитела обладали сходными параметрами скорости связывания (Kforward, on-rate) и скорости диссоциации (Kreverse, off-rate) - приведены на Рис. 33 и в Таб. 3. Малая скорость диссоциации должна позволить антителу А9 удерживать связанный TNF.

Кинетика взаимодействия биспецифического антитела А9 и контрольного антитела тА9 с рекомбинантным TNF человека. (А) Приведены кривые взаимодействия (сенсограммы) рекомбинантного TNF человека в концентрациях 50 нМ - 3 нМ с сенсорным чипом, на котором были иммобилизованы биспецифическое антитело А9 и контрольное антитело тА9. По оси абсцисс отложено время в секундах, по оси ординат сдвиг угла резонанса в условных единицах (УЕ). (Б) Для каждой группы сенсограмм были расчитаны значения скорости связывания (оп-rate), скорости диссоциации (off-rate) и константы диссоциации (Kd). Полученные средние значения, а также стандартное отклонение (SD) отложены на диаграмме изоаффиности. Диагональные линии соответсвуют указанным значениям константы диссоциации.

Для оценки сравнительной активности антитела А9 в ингибировании биологических эффектов TNF проводился цитотоксический текст на линии мышиной фибросаркомы L929. К постоянным концентрациям рекомбинантного TNF человека и актиномицина-D добавлялись серийные разведения антител А9 и тА9. Согласно полученным данным антитела А9 и тА9 имеют близкую антиNF активность (Рис. 34 А). Кроме того было подтверждено, что активность биспецифического антитела А9 соответствует активности однодоменного антиNF антитела hTNF-VffH, которое входит в состав А9 и тА9 (Рис. 34 Б). 10 10 10

АнтиNF активность биспецифического антитела А9, контрольного антитела mA9 и однодоменного антитела hTNF-VffH. (А) Сравнение активности биспецифического антитела А9 и контрольного антитела тА9. Приведена кривая выживаемости клеток мышиной фибросаркомы L929 при одновременном воздействии константной дозы TNF человека и убывающих доз антител А9 и тА9. (Б) Сравнение активности биспецифического антитела А9 и однодоменного антитела hTNF-VnH. Приведена кривая выживаемости клеток мышиной фибросаркомы L929 при одновременном воздействии константной дозы TNF человека и убывающих доз антител А9 и hTNF-VHH.Сравнение проводилось в молярных концентрациях для того, чтобы исключить влияния различий в молярной массе на определяемую активность антитела.

Анализ связывания антител А9 и тА9 с поверхностью макрофагов через взаимодействие с поверхностной молекулой F4/80.

Способность биспецифического антитела А9 специфически связываться с поверхностью макрофагов была оценена методом проточной цитофлуориметрии. Для этого клетки, выделенные из перитонеальной полости, инкубировались с антителами А9, после чего проводилось окращивание на макрофагальные маркеры CD1 lb и F4/80, одновременно осуществлялось специфическое окрашивание на биспецифическое антитело А9 через антитела к VHH ИЛИ антитела к полигистидиновой метке. Затем образцы подвергались проточной цитофлуориметрии и анализу.

Эти эксперименты показали, что биспецифическое антитело А9 способно связываться с поверхностью перитонеальных клеток, экспрессирующих F4/80 и CD1 lb на своей поверхности (моноциты и макрофаги) (Рис. 35 А - Г). В то же время, А9 не связывается с клетками перитонеальной полости, не имеющими этих маркеров (преимущественно лимфоциты) (Рис. 35 Д и Е). Снижения уровня параллельного анти-F4/80 окрашивания при добавлении антитела А9 за счет конкуренции двух антител за связывание с мишенью подтверждает, что А9 специфически взаимодействует именно с этой молекулой на поверхности клеток (Рис. 35 Ж и 3).

Также используется название Мас-1. Составной элемент рецептора СЗ компонента системы комплемента. У мышей экспрессируется на моноцитах, макрофагах и клетках микроглии. биспецифическое антитело

Клетки перитонеальной полости инкубировались с биспецифическим антителом А9 (изображено красным цветом) или без него (изображено синим цветом), а затем подвергались окрашиванию флуоресцентно меченными антителами к поверхностным маркерам, специфичным для клеток моноцитарно-макрофагального ряда, а также антителами, специфичными к А9. Затем полученные образцы анализировались методом проточной цитофлуориметрии. (А, В, Д, Ж) окрашивание через антитела к VHH домену. (Б, Г, Е, 3) окрашивание через антитела к полигексидиновой последовательности. (А, Б) биспецифическое антитело А9 связывается с клетками, отобранными по высокому уровню экспрессии F4/80 и CD1 lb (макрофаги). На изображеной гистограмме по горизонтальной оси отложено значение флуоресценции в канале окрашивания на А9, по вертикальной оси нормализованная частота встречаемости события. (В, Г) то же самое в форме гистограммы рассеяния. По горизонтальной оси отложено значение флуоресценции в канале окрашивания на А9, по вертикальной оси значение флуоресценции в канале окрашивания на F4/80. (Д, Е) -биспецифическое антитело А9 не связывается с клетками перитонеальной полости, не экспрессирующими F4/80 и CD1 lb (лимфоциты). На изображеной гистограмме по горизонтальной оси отложено значение флуоресценции в канале окрашивания на А9, по вертикальной оси нормализованная частота встречаемости события. (Ж, 3) -инкубация с биспецифическим антителом А9 снижает интенсивность окрашивания на F4/80. На изображеной гистограмме по горизонтальной оси отложено значение флуоресценции в канале окрашивания на F4/80, по вертикальной оси нормализованная частота встречаемости события.

Костномозговые макрофаги инкубировались с биспецифическим антителом А9 (изображено красным цветом), без него (изображено синим цветом), или с контрольным антителом тА9 (изображено черным цветом) а затем подвергались окрашиванию антителами, специфичными к А9/тА9. Полученные образцы анализировались методом проточной цитофлуориметрии. (А) биспецифическое антитело А9 специфически связывается с костномозговыми макрофагами. На изображеной гистограмме по горизонтальной оси отложено значение флуоресценции в канале окрашивания на А9, по вертикальной оси нормализованная частота встречаемости события. (Б) контрольное антитело шА9 неспособно связываться с костномозговыми макрофагами. На изображеной гистограмме по горизонтальной оси отложено значение флуоресценции в канале окрашивания на шА9, по вертикальной оси нормализованная частота встречаемости события.

Кроме того, в дополнительных цитофлуориметрических экспериментах было показано, что антитело А9, будучи прикрепленным к поверхности макрофагов, способно одновременно связывать экзогенно добавленный TNF человека (Рис. 37). Что подтверждает, что обе субъединицы биспецифического антитела функционально активны одновременно, и что связывание двух антигенов одновременно стерически возможно.

Клетки перитонеальной полости инкубировались с биспецифическим антителом А9 (изображено красным цветом) или без него (изображено синим цветом), затем с рекомбинантным TNF человека, после чего подвергались окрашиванию флуоресцентно-меченными антителами к поверхностным маркерам, специфичным для клеток моноцитарно-макрофагального ряда, а также антителами, специфичными к TNF человека. Полученные образцы анализировались методом проточной цитофлуориметрии. (А) биспецифическое антитело А9, способно удерживать TNF человека на поверхности макрофагов (клеток, отобранных по высокому уровню экспрессии F4/80 и CD1 lb). На изображеной гистограмме по горизонтальной оси отложено значение флуоресценции в канале окрашивания на TNF, по вертикальной оси нормализованная частота встречаемости события. (Б) те же данные в форме гистограммы рассеяния. По горизонтальной оси отложены значения флуоресценции в канале окрашивания на TNF, по вертикальной оси значения флуоресценции в канале окрашивания на F4/80.