Идентификации белков активное применение. Методы выделения, очистки, идентификации и изучения мембранных структур

высаливание : осаждение солями щелочных, щелочноземельных металлов (хлорид натрия, сульфат магния), сульфатом аммония; при этом не нарушается первичная структура белка;

осаждение : использование водоотнимающих веществ: спирт или ацетон при низких температурах (около –20 С).

При использовании этих методов белки лишаются гидратной оболочки и выпадают в осадок в растворе.

Денатурация - нарушение пространственной структуры белков (первичная структура молекулы сохраняется). Может быть обратимая (структура белка восстанавливается после устранения денатурирующего агента) или необратимая (пространственная структура молекулы не восстанавливается, например, при осаждении белков минеральными концентрированными кислотами, солями тяжелых металлов).

Методы разделения белков Отделение белков от низкомолекулярных примесей

Диализ

Используют специальную полимерную мембрану, которая имеет поры определенной величины. Малые молекулы (низкомолекулярные примеси) проходят через поры в мембране, а крупные (белки) задерживаются. Таким образом, белки отмывают от примесей.

Разделение белков по молекулярной массе

Гель-хроматография

Хроматографическую колонку заполняют гранулами геля (сефадекс), который имеет поры определенной величины. В колонку вносят смесь белков. Белки, размер которых меньше, чем размер пор сефадекса, задерживаются в колонке, так как «застревают» в порах, а остальные свободно выходят из колонки (рис. 2.1). Размер белка зависит от его молекулярной массы.

Рис. 2.1. Разделение белков методом гель-фильтрации

Ультрацентрифугирование

Этот метод основан на различной скорости седиментации (осаждения) белковых молекул в растворах с различным градиентом плотности (сахарозный буфер или хлорид цезия) (рис. 2.2).

Рис. 2.2. Разделение белков методом ультрацентрифугирования

Электрофорез

Данный метод основан на различной скорости миграции белков и пептидов в электрическом поле в зависимости от заряда.

Носителями для электрофореза могут служить гели, ацетатцеллюлоза, агар. Разделяемые молекулы движутся в геле в зависимости от размера: те из них, которые имеют бóльшие размеры, будут задерживаться при прохождении через поры геля. Меньшие молекулы будут встречать меньшее сопротивление и, соответственно, двигаться быстрее. В результате, после проведения электрофореза, бóльшие молекулы будут находиться ближе к старту, чем меньшие (рис. 2.3).

Рис. 2.3 . Разделение белков методом электрофореза в геле

Методом электрофореза можно разделить белки и по молекулярной массе. Для этого используют электрофорез в ПААГ в присутствии додецилсульфата натрия (ДДS-Na) .

Выделение индивидуальных белков

Аффинная хроматография

Метод основан на способности белков прочно связываться с различными молекулами нековалентными связями. Используется для выделения и очистки ферментов, иммуноглобулинов, рецепторных белков.

Молекулы веществ (лиганды), с которыми специфически связываются определенные белки, ковалентно соединяют с частицами инертного вещества. Смесь белков вносят в колонку, и искомый белок прочно присоединяется к лиганду. Остальные белки свободно выходят из колонки. Задержанный белок затем можно вымыть из колонки с помощью буферного раствора, содержащего в свободном состоянии лиганд. Этот высокочувствительный метод позволяет выделить в чистом виде очень малые количества белка из клеточного экстракта, содержащего сотни других белков.

Изоэлектрофокусирование

Метод основан на различной величине ИЭТ белков. Белки разделяют методом электрофореза на пластине с амфолином (это вещество, у которого заранее сформирован градиент pH в диапазоне от 3 до 10). При электрофорезе белки разделяются в соответствии со значением их ИЭТ (в ИЭТ заряд белка будет равен нулю, и он не будет передвигаться в электрическом поле).

Двухмерный электрофорез

Представляет собой сочетание изоэлектрофокусирования и электрофореза с ДДС-Na. Проводят сначала электрофорез в горизонтальном направлении на пластине с амфолином. Белки разделяются в зависимости от заряда (ИЭТ). Затем обрабатывают пластину раствором ДДС-Na и проводят электрофорез в вертикальном направлении. Белки разделяются в зависимости от молекулярной массы.

Иммуноэлектрофорез (Вестерн-блот)

Аналитический метод, используемый для определения специфичных белков в образце (рис 2.4).

Выделение белков из биологического материала.

Разделение белков по молекулярной массе методом электрофореза в ПААГ с ДДС-Na.

Перенос белков с геля на полимерную пластину с целью облегчения дальнейших работ.

Обработка пластины раствором неспецифического белка для заполнения оставшихся пор.

Таким образом, после этого этапа получена пластинка, в порах которой содержатся разделенные белки, а пространство между ними заполнено неспецифическим белком. Теперь надо выявить, есть ли среди белков искомый, ответственный за какое-то заболевание. Для выявления используют обработку антителами. Под первичными антителами понимают антитела к искомому белку. Под вторичными антителами понимают антитела к первичным антителам. В состав вторичных антител вводят дополнительно специальную метку (т.н. молекулярный зонд), чтобы потом можно было визуализировать результаты. В качестве метки используются радиоактивный фосфат или фермент, прочно связанные с вторичным антителом. Связывание сначала с первичными, а затем с вторичными антителами преследует две цели: стандартизация метода и улучшение результатов.

Обработка раствором первичных антител  связывание происходит в том месте пластины, где есть антиген (искомый белок).

Удаление несвязавшихся антител (промывка).

Обработка раствором меченых вторичных антител для последующей проявки.

Удаление несвязавшихся вторичных антител (промывка).

Рис. 2.4 . Иммуноэлектрофорез (Вестерн-блот)

В случае присутствия искомого белка в биологическом материале – на пластинке появляется полоса, свидетельствующая о связывании этого белка с соответствующими антителами.

Книга представляет собой первое учебное пособие на русском языке по основам масс-спектрометрии белков и пептидов. Цель настоящего издания - заинтересовать молодых исследователей информативной, красивой и востребованной во всем мире дисциплиной, дать возможность более эффективно применять масс-спектрометрию для решения фундаментальных и прикладных научных задач. Книга написана в формате лекций для начинающих, хорошо иллюстрирована и сопровождается представительным списком цитированной литературы.

Издание рассчитано на студентов и аспирантов химических, физико-химических, биологических и медицинских специальностей; будет полезно научным сотрудникам, уже работающим в области исследований белков и пептидов или интересующимся этим научным направлением.

Предисловие

Посвящается
профессорам химического факультета
МГУ им. М.В. Ломоносова
Александру Леонидовичу Курцу
Киму Петровичу Бутину

Важнейшие достижения масс-спектрометрии за последние 20 лет связаны с исследованиями природных соединений, включая биополимеры. С появлением методов ионизации электрораспылением и матрично-активированной лазерной десорбции/ионизации для масс-спектрометрии стали доступны сахара, нуклеиновые кислоты, белки, липиды и прочие биоорганические макромолекулы. Безусловно, наибольших успехов удалось достичь в исследовании белков. Благодаря чувствительности, информативности, экспрессности, возможности работать со смесями, масс-спектрометрия сегодня - основной метод анализа этих сложных для изучения объектов.

Пожалуй, можно признать, что современная масс-спектрометрия выиграла конкурентную борьбу с классическим методом установления первичной последовательности аминокислот в пептидах по Эдману, поскольку масс-спектрометрическое секвенирование оказалась существенно быстрее, чувствительнее, информативнее и даже дешевле. Быстрое и надежное определение первичной структуры белков, т.е. последовательности аминокислотных звеньев, само по себе уже превосходный результат. Однако масс-спектрометрия способна изучать структуры более сложных порядков (от 2 до 4), включая нековалентные взаимодействия белков с появлением надбелковых образований, устанавливать тип и место посттрансляционных модификаций, работать с гликопротеинами, липопротеинами, фосфопротеинами и т.д. Масс-спектрометрия стала незаменимой в медицине, поскольку способна быстро и надежно диагностировать сердечно-сосудистые, генетические и онкологические заболевания. Именно успехи масс-спектрометрии привели к формированию в конце прошлого века нового научного направления - протеомики. Огромна роль метода и в метаболомике.

К сожалению, в русскоязычной литературе до сих пор не существовало учебных пособий или монографий по этой важнейшей и многогранной по своему применению тематике. Россия кардинально отстает от развитых стран и по изучению этой дисциплины, и по использованию ее достижений. Масс-спектрометристам, работающим в России, приходится ориентироваться на англоязычные издания книг, оригинальные статьи и обзоры. В 2012 г. на русском языке была издана книга "Принципы масс-спектрометрии в приложении к биомолекулам" под редакцией Дж. Ласкин и X. Лифшиц (перевод с английского, изд-во "Техносфера"), представляющая собой сборник статей ведущих специалистов в области масс-спектрометрии в приложении к биологии. Книга рассчитана на подготовленных читателей. Она предоставляет

хорошую, во многом, заочную возможность познакомиться с современными достижениями в области масс-спектрометрии биомолекул, поскольку большинство описываемых в ней методов пока не используется в нашей стране.

Предлагаемая читателям книга "Основы масс-спектрометрии белков и пептидов" является первым учебным пособием на русском языке, излагающим основы масс-спектрометрии белков и пептидов. Книга написана в формате лекций для начинающих, иллюстрирована большим количеством рисунков, спектров, схем и сопровождается представительным списком цитированной литературы. Она рассчитана на студентов и аспирантов химических, физико-химических, биологических и медицинских специальностей; будет полезна научным сотрудникам, уже работающим в области исследований белков и пептидов или интересующимся этим научным направлением.

Цель издания такой книги - заинтересовать молодых исследователей информативной, очень красивой и востребованной во всем мире дисциплиной, дать возможность более эффективно применять масс-спектрометрию для решения своих собственных фундаментальных и прикладных научных задач.

Основное внимание в учебном пособии уделено методам ионизации белков и пептидов, процессам фрагментации этих соединений в газовой фазе. Достаточно подробно рассматриваются вопросы тандемной масс-спектрометрии, существующие методы инициирования фрагментации. Этот раздел очень важен в современной масс-спектрометрии. Он полезен для исследователей, работающих с любыми химическими соединениями и биополимерами. Несколько глав посвящены идентификации белков и пептидов. Сюда входят варианты автоматизированной идентификации, расшифровка спектров вручную, описание определенных сложностей масс-спектрометрического секве-нирования и вариантов их преодоления. Рассмотрены достоинства и недостатки двух основных подходов установления химической структуры белков: масс-спектрометрии "сверху-вниз" и "снизу-вверх". Отдельная глава посвящена вопросам количественного анализа.

Книга посвящена Александру Леонидовичу Курцу и Киму Петровичу Бутину, двум друзьям, замечательным профессорам химического факультета Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова, очень близких нам в человеческом отношении, непосредственно участвовавшим в нашем химическом и гуманитарном образовании. Мы всегда высоко оценивали химическую эрудицию и потрясающие личностные качества этих ученых. Именно общение с этими людьми вдохновило нас в самом начале XXI века начать исследования в области масс-спектрометрии пептидов.

А.Т. Лебедев
К.А. Артеменко
Т.Ю. Самгина

Для идентификации белков используются различные системы поиска в базах данных EMBL, Sequest, разработанные внутри исследовательских коллективов. Однако стандартом для идентификации белков стала поисковая машина Mascot. Как практически во всех поисковых системах в ней используется вэб-интнерфейс и сама поисковая система доступна в Интернете, но ее также можно приобрести и установить на компьютере пользователя.

Mascot может работать с различными подключаемыми белковыми и геномными базами данных. Это могут быть обширные общедоступные базы, такие как NCBI или SwissProt, коммерческие, а также созданные самим пользователем.

Во всех системах идентификация осуществляется по полученным исследователем масс-спектрометрическим данным, путем их сопоставления с известными структурами белков.

Учитывая, что в последние десятилетия сиквенирование белков свелось, по сути, с сиквенированию кодирующих их генов, на практике разумнее идентифицировать белки сопоставляя экспериментальные масс-спектрометрические данные с известными геномами.

Существуют различные алгоритмы идентификации белков, однако их возможности ограничены известными на сегодняшний день геномами. Хотя, учитывая что организмы разных видов все-таки имют гомологичные белки, зачастую удается идентифицировать белки из организмов с неизвестным геномом.

Различные методические подходы протеомных исследований, дают принципиально различные типы данных, и требуют своих вычислительных подходов при обработке.

Наиболее доступным и высокопроизводительном является метод идентификации по масс-спетрометрическим пептидным картам специфического протеолитического гидролиза. В англоязычной литературе он известен как Peptide Mass Fingerprint (PMF) В качестве специфической протеазы чаще всего используется трипсин. На первом этапе выделенный (например, элетрофорезом) белок подвергается протеолитическому гидролизу. В результате такого гидролиза получается смесь пептидов. Учитывая, что используется высокоспецифичная протеаза, это будет смесь вполне определенных пептидов. Так, при использовании трипсина белок будет "порезан" по аргинину и лизину.

Следующий этап - регистрация масс-спектра полученной смеси. В результате чего получается набор или список молекулярных масс. Он не дает никакой информации о структуре или других свойствах продуктов, в основе метода только предположение что это молекулярные массы пептидов, и эти пептиды образовались в результате специфического гидролиза. Здесь и спрятана главная идея подхода - если каждый белок имеет свой набор пептидов и соответствующий ему перечень молекулярных масс, то вполне возможно и решение обратной задачи - найти для полученного перечня молекулярных масс соответствующий ему белок. И такую задачу действительно часто удается решить.

В частности это позволяет сделать маскот.

Заголовок

Выделение и очистка белков осуществляется поэтапно.

1. Гомогенизация – это тщательное измельчение объектов биохимического исследования до однородного, то есть гомогенного состояния, то есть белки подвергаются тщательной дезинтеграции вплоть до разрушения клеточной стенки.
При этом используют:
а) ножевые гомогенизаторы типа Уорринга;
б) пестиковые гомогенизаторы Поттера - Эльвегейма;
в) шаровые и валковые мельницы – для более плотных объектов;
г) метод попеременного замораживания и оттаивания, при этом разрыв клеточной стенки происходит под действием кристалликов льда;
д) метод «азотной бомбы» – под высоким давлением клетки насыщаются азотом, затем давление резко сбрасывают, выделяется газообразный азот, который как бы взрывает клетку изнутри;
е) УЗ, различные пресс - методы, переваривание клеточных стенок ферментами. В большинстве случаев при гомогенизации выделяется тепло, при этом многие белки могут инактивироваться, поэтому все процедуры проводятся в холодных помещениях при t 0 или охлаждают сырье с помощью льда. При этом тщательно контролируют объем и время разрушения клеток, рабочее давление. Идеальным считается такой гомогенизат, который может подвергнуться дальнейшему экстрагированию.

2. Экстракция белков , то есть их перевод в растворенное состояние; чаще всего экстракцию проводят вместе с измельчением одновременно.

Экстракцию проводят:
а) растворением в 8-10% растворах солей;
б) с использованием буферных растворов с рН от кислых до слабощелочных (боратных, фосфатных, цитратных, трис - буферных: смесь трисаминометана с NH2 – CH3 + HCl;
в) осаждение белков органическими растворителями (этанол, метанол, бутанол, ацетон и их комбинациями), при этом происходит расщепление белково-липидных и белково-белковых компонентов, то есть разрушение ЧСБ.

3. Очистка и фракционирование белков. После экстрагирования производят разделение или фракционирование смеси на индивидуальные белки и их дальнейшую очистку:

а) высаливание – это процесс осаждения белков нейтральными солевыми растворами щелочных и щелочноземельных металлов.

Механизм высаливания – добавляемые анионы и катионы разрушают гидратную белковую оболочку белков, являющуюся одним из факторов устойчивости белковых растворов. Чаще всего применяются растворы сульфатов Na и аммония. Многие белки отличаются по размеру гидратной оболочки и величине заряда. Для каждого белка есть своя зона высаливания. После удаления высаливающего агента белок сохраняет свою биологическую активность и физико-химические свойства. В клинической практике применяется метод высаливания для разделения глобулинов (при добавлении 50% раствора сульфата аммония (NH 4)2SO 4 выпадает осадок) и альбуминов (при добавлении 100% раствора сульфата аммония (NH 4)2SO 4 выпадает осадок).

На величину высаливания оказывают влияние:
1) природа и концентрация соли;
2) рН-среды;
3) температура.

Главную роль при этом играют валентности ионов. Поэтому действие соли оценивают по ионной силе раствора μ:

, то есть ионная сила раствора (μ) равна произведению ½ концентрации каждого иона (С) на квадрат его валентности (V).

Метод Кона является разновидностью высаливания. Одновременно происходит экстракция и осаждения компонентов. Изменяя последовательно температуру (обычно низкие t o –0+8 o С), рН раствора и концентрированного этанола, из плазмы крови последовательно выделяют до 18 фракций белков.

Метод Кона применяют в фармацевтическом производстве при получении кровезаменителей;
б) методы хроматографии . Основоположником разработки хроматографических методов анализа считается русский ученый Михаил Цвет (1903). В настоящее время существует много ее разновидностей. В основе метода лежит способность веществ специфически адсорбироваться на адсорбенте, заключенном в колонку или помещенном на каком-либо носителе. При этом происходит разделение анализируемых веществ и их концентрирование в строго определенном слое адсорбента. Затем через колонку пропускают соответствующие элюенты (растворители), которые ослабляют силы адсорбции и вымывают адсорбированные вещества из колонки. Вещества собираются в коллекторе фракций.

Основополагающим в хроматографии является коэффициент распределения , который равен отношению концентрации вещества в подвижной фазе к концентрации вещества в неподвижной фазе (или стационарной фазе ).

Неподвижная стационарная фаза – может быть твердой или жидкой или смесью твердой и жидкой.

Подвижная фаза – жидкая или газообразная, она течет по стационарной, или пропускается через нее.

В зависимости от вида стационарной и подвижной фазы бывают различные модификации хроматографического анализа.

Адсорбционная – основана на различной степени адсорбции белков адсорбентом и растворимости их в соответствующем растворителе.

Применяемые адсорбенты – кремниевая кислота, Al 2 О 3 , CaCO 3 , MgO, древесный уголь. Адсорбент в виде суспензии с растворителем (чаще с буферным раствором) упаковывают в колонке (стеклянная вертикальная трубка). Образец наносят на колонку, затем через нее пропускают растворитель или смесь растворителей.

Разделение основано на том, что вещества с более высоким К распр. (Б), продвигаются по колонке с большей скоростью. Сбор фракций осуществляется с помощью коллектора фракций.

Распределительная хроматография – основана на распределении смеси белков между двумя жидкими фазами. Разделение может происходить на специальной хроматографической бумаге, а также в колонках, как в адсорбционной. Твердая фаза в данном случае служит только опорой для жидкой стационарной фазы. Хроматографическая бумага обладает свойством задерживать воду между своими целлюлозными волокнами. Эта вода - неподвижная стационарная фаза. Когда по бумаге под действием капиллярных сил движется неводный растворитель (подвижная фаза), молекулы вещества, нанесенного на бумагу, распределяются между двумя фазами в соответствии с их коэффициентом распределения. Чем выше растворимость вещества в подвижной фазе, тем дальше оно продвинется по бумаге вместе с растворителем.
В случае распределения хроматографии на колонке – носители – это целлюлоза, крахмал, силикагель и др., неподвижная фаза – вода. При нанесении на колонку вещества смеси движутся по колонке с разной скоростью с учетом Краспр.

Rf для каждого соединения в стандартных условиях величина постоянная.
Ионообменная хроматография – основана на притяжении противоположно заряженных частиц. Для этого используют различные ионообменные смолы: катионообменные – содержат отрицательно заряженные группы – сульфированные стиролы и КМЦ, которые притягивают положительно заряженные ионы исследуемых веществ. Их называют также кислотными ионообменниками.
Анионообменные смолы, или основные ионообменники, содержат положительно заряженные группы, притягивающие отрицательно заряженные молекулы белков
Триметиламиностирол, это производное стиролов и целлюлозы.
В зависимости от q разделяемых белков используют соответствующие ионообменники, с которыми взаимодействуют определенные белки, а другие беспрепятственно выходят из колонки. «Осажденные» на колонке белки снимают, используя более концентрированные солевые растворы или изменяя рН элюента.
Аффинная хроматография (или хроматография по сродству) основана на принципе избирательного взаимодействия белков или других макромолекул с иммобилизованными на носителях специфическими веществами – лигандами (это может быть кофермент, если выделяют фермент, антитело антиген и др. Благодаря высокой специфичности белков к иммобилизованным лигандам к нему присоединяется только один белок из смеси. Смывается буферными смесями с измененным рН или измененной ионной силой.
Достоинство – возможность одноэтапно выделить заданное вещество высокой степени чистоты.
Метод гель - фильтрации или метод молекулярных «сит» - это разновидность проникающей хроматографии.
Разделение молекул по размерам и форме основано на свойствах молекулярного сита, которые обладают многие пористые материалы, например органические полимеры с трехмерной сетчатой структурой, придающей им свойства гелей. Гель фильтрация – это разделение веществ с помощью гелей, основанное на различиях в размере молекул (сефароза, сефадекс, сефакрил, биогели и т.д.). Под действием эпихлоргидрина полисахаридные цепочки декстрана (синтезируется микроорганизмами) сшиваются в сетчатую структуру, становятся нерастворимыми в воде, но сохраняют к ней большое сродство. Благодаря этой гидрофильности полученные зерна (называемые сефадексом) сильно набухают с образованием геля, которым заполняют колонку. Метод основан на том, что крупные молекулы не проникают во внутреннюю водную фазу, а более мелкие молекулы сперва проникают в поры «сита», как бы застревают в них, а поэтому движутся с меньшей скоростью. Соответственно белки с большей Mr первыми поступают в приемник. В последнее время в проникающей хроматографии все чаще используют в качестве молекулярного сита пористые стеклянные гранулы.
Электрофоретический метод в биохимии – основан на различии скорости передвижения молекул в электрическом поле (аминокислоты, пептиды, белки, нуклеиновые кислоты).
Различие скорости движения зависит:
1. от q молекулы: подвижность молекул тем больше, чем больше суммарный q. Величина q зависит от рН;
2. от размеров молекул: чем крупнее молекулы, тем меньше их подвижность. Это связано с возрастанием сил трения и электростатических взаимодействий крупных молекул с окружающей средой;
3. от формы молекул: молекулы одинакового размера, но различной формы, например, фибрилл и глобул белка обладают различной скоростью. Это связано с различиями в силах трения и электростатического взаимодействия.
Виды электрофореза
а) Изоэлектрическое фокусирование. Разделение происходит на вертикальной колонке в град. как рН, так и напряжения. С помощью специальных носителей амфолитов в колонке устанавливается град. рН от 0 до 14. В колонку помещают смесь веществ, подключаю электроток. Каждый из компонентов движется к той части колонки, где значение рН соответствует его изоэлектрической точке и там останавливается, то есть фокусируется.
Достоинство: происходит разделение, очистка и идентификация белков в один прием. У метода высокая разрешительная способность (0,02 pI).
б) Изотахофорез – это электрофорез на поддерживающих средах. После включения электротока ионы с самой высокой подвижностью движутся к соответствующему электроду первыми, с самой низкой – последними, обладающие промежуточной подвижностью – располагаются посередине.
в) Диск-электрофорез – прибор состоит из двух сосудов с буфером – верхнего и нижнего, соединенных вертикальными трубками, содержащими разнопористый гель. По мере движения ионизированных частиц под действием электротока. Более высокая пористость – в верхней части геля.
г) Иммуноэлектрофорез – метод сочетающий электрофорез с иммунодиффузией (для обнаружения антигенов в сложных физиологических смесях). На специальный носитель перпендикулярно друг другу помещают смесь антигенов и смесь антител. При включении электротока они разделяются на индивидуальные вещества и диффундируют на гелевом носителе. В месте встречи антигена с соответствующим антителом происходит специфическая реакция преципитации в форме дуги. Количеств образовавшихся дуг соответствует количеству антигенов.

Методы определения Mr белков

У большого числа белков химический состав и последовательность аминокислот не установлена (1010–1012 белков), поэтому у таких белков определяют Mr. При этом используются различные методы.
а) Седиментационный метод – определение Mr проводят в специальных центрифугах (первая центрифуга была предложена шведским биохимиком Сведбергом), в которых удается создать центробежное ускорение, которое больше в 200 тыс. и более раз ускорения земного притяжения. Mr определяют по V седиментации молекул. По мере перемещения молекул от центра к периферии образуется резкая граница белок-растворитель. Скорость седиментации выражают через константу седиментации (S):

где V – скорость перемещения границы белок-растворитель (см/с);
 – угловая скорость ротора (рад/с);
 – расстояние от центра ротора до середины ячейки с раствором белков (см).
Величина константы седиментации S, которая равна 110–13 С условно принята за 1 и называется 1 Сведбергом (S). S для белков лежит в пределах 1-50 S, иногда до 100 S.
Mr белков определяется по уравнению Сведберга:

где R – универсальная газовая постоянная;
Т – абсолютная температура по Кельвину;
S – константа седиментации;
Д – коэффициент диффузии;
 – плотность растворителя;
V – парциальный удельный объем газа.
Этот метод дорогостоящий из-за применения аппаратуры.
Более просты и дешевы:
б) Гель-фильтрация в тонком слое сефадекса.
Длина пробега белка (в мм) находится в логарифмической зависимости от Mr.
Х – Mr искомого белка на калибровочном графике.
в) Диск-электрофорез в полиакриламидном слое – также существует зависимость между логарифмом Mr калибровочных белков и длиной их пробега.

Методы определения гомогенности белков

Степень чистоты выделенного белка определяется:

• ультрацентрифугированием;
• методом диск - электрофореза;
• различными иммунохимическими методами;
• определением растворимости белка (метод Нортропа) основан на правиле фаз, согласно которому растворимость чистого вещества при данных условиях опыта зависит только от температуры, но не зависит от концентрации вещества в твердой фазе.

Если белок гомогенный, то на графике получается один перегиб (а), если есть примеси белков (б, в), то получим несколько перегибов кривой насыщения. У всех белков свои индивидуальные кривые растворимости.

480 руб. | 150 грн. | 7,5 долл. ", MOUSEOFF, FGCOLOR, "#FFFFCC",BGCOLOR, "#393939");" onMouseOut="return nd();"> Диссертация - 480 руб., доставка 10 минут , круглосуточно, без выходных и праздников

Кайшева, Анна Леонидовна. Масс-спектрометрическая идентификация белков и белковых комплексов на чипах атомно-силового микроскопа: диссертация... кандидата биологических наук: 03.01.04 / Кайшева Анна Леонидовна; [Место защиты: Науч.-исслед. ин-т биомед. химии им. В.Н. Ореховича РАМН].- Москва, 2010.- 104 с.: ил. РГБ ОД, 61 10-3/1308

Введение

Глава 1. Обзор литературы 10

1.1. Анализ научно-технического задела в области высокочувствительных протеомных технологий

1.2 Характеристика вируса гепатита С 20

1.2.1 Методы диагностики гепатита С 22

1.2.2 Серологические белковые маркеры гепатита С 25

Глава 2. Материалы и методы 28

2.1 АСМ-чипы 28

2.2 Препараты белков и реактивы 29

2.3 АСМ-анализ 30

2.4 Подготовка образцов для масс-спектрометрического анализа 31

2.5 Масс-спектрометрический анализ 33

2.5.1 МАЛДИ-МС-анализ белков на поверхности АСМ-чипа 33

2.5.2 ЭСИ-МС-анализ белков на поверхности АСМ-чипа 34

Глава 3. Результаты и их обсуждение 35

3.1 МС -идентификация белков, выловленных с помощью «химического фишинга» на поверхность АСМ-чипа из раствора аналита

3.2 МС-идентификация белков, биоспецифически выловленных на поверхности АСМ-чипа из раствора аналита

3.3 МС-идентификация белков на поверхности АСМ-чипа, биоспецифически выловленных из образцов сыворотки крови

Заключение 83

Литература

Введение к работе

Актуальность работы.

Одним из приоритетных направлений в современной биохимии является создание эффективных аналитических методов для протеомного анализа, главная задача которых заключается в обнаружении и инвентаризации белков организма, исследовании их структуры, функций, выявлении белковых взаимодействий. Решение данной задачи позволит создать новые системы диагностики заболеваний и их лечения. Стандартные методы современного протеомного анализа базируются на разделении многокомпонентных белковых смесей с помощью хроматографии, электрофореза в комбинации с масс-спектрометрическими методами (МС) идентификации белков. При несомненном достоинстве стандартного МС-анализа в плане быстродействия и достоверности идентификации белковых молекул, он обладает существенными ограничениями применения, обусловленными низкой

концентрационной чувствительностью анализа на уровне 10" "10" М и высоким динамическим диапазоном содержания белков в биологическом материале. В то же время подавляющее количество функциональных белков, в том числе биомаркеры таких социально-значимых заболеваний, как вирусные гепатиты В и С, онкомаркеры и др., присутствуют в плазме крови в области концентраций 10" Ми менее.

Один из путей преодоления такого методологического ограничения концентрационной чувствительности анализа заключается в использовании биомолекулярных детекторов, которые позволяют регистрировать единичные молекулы и их комплексы и теоретически не имеют ограничений концентрационной чувствительности. К биомолекулярным детекторам относятся детекторы на базе нанотехнологических устройств, таких как атомно-силовые микроскопы (АСМ), нанопроводные детекторы, нанопоры и ряд других детекторов. Уникальная чувствительность АСМ-детекторов позволяет визуализировать отдельные молекулы белков и подсчитывать их количество. При использования АСМ в качестве биомолекулярного детектора необходимо применение специальных чипов, позволяющих сконцентрировать биологические макромолекулы аналита из большого объема инкубационного раствора на ограниченной поверхности чипа. Исследуемые белковые объекты могут быть сконцентрированы на поверхности чипа как за счет физической или химической адсорбции, так и за счет биоспецифических взаимодействий (АСМ-биоспецифический фишинг).

Однако на практике ограничение применения нанодетекторов на базе АСМ заключается в том, что несмотря на возможность визуализации отдельных белковых молекул на поверхности чипа, такие детекторы не способны идентифицировать их, что особенно важно в исследовании сложных белковых смесей, в том числе биологического материала. Поэтому разработка метода анализа, дополняющего возможности метода АСМ, представляется актуальной задачей. На сегодняшний день единственным протеомным методом, позволяющим однозначно и достоверно идентифицировать белковые молекулы, является МС-анализ. В диссертационной работе разработан подход, объединяющий высокую чувствительность метода АСМ и достоверную МС-идентификацию для детекции белков и их комплексов из раствора аналита.

Цель и задачи исследования.

Цель настоящей работы состояла в масс-спектрометрической идентификации белков и белковых комплексов, выявленных в биоматериале с помощью атомно-силовой микроскопии.

Для достижения поставленной цели были решены следующие задачи:

Разработана схема МС-идентификации белков, выловленных на поверхность АСМ-чипа с помощью химического или биоспецифического фишинга;

Разработаны условия ферментативного гидролиза белков на поверхности АСМ-чипа для последующей МС-идентификации;

Проведена МС-идентификация модельных белков на поверхности АСМ-чипа;

Проведена МС-идентификация белков на поверхности АСМ-чипа, биоспецифически выловленных из многокомпонентной смеси (сыворотки).

Научная новизна работы .

В диссертации разработана схема, позволяющая проводить МС-идентификацию белков и белковых комплексов, выловленных из раствора или многокомпонентной смеси на поверхности АСМ-чипа. Для этого были подобраны оптимальные условия подготовки образцов, в том числе режим проведения гидролиза (температурный режим, влажность, состав трипсинолитической смеси, время трипсинолиза) белковых молекул, ковалентно и нековалентно иммобилизованных на поверхности АСМ-чипа. Особенность настоящей работы заключалась в том, что по сравнению со стандартными протеомными протоколами ферментативного гидролиза подготовка образцов для МС-анализа проводилась не в растворе, а на ограниченной площади

поверхности чипа. Разработанная схема позволила эффективно провести МС-анализ и идентифицировать на поверхности АСМ-чипа как отдельные белки, так и белковые комплексы. МС-анализ протеотипических пептидов исследуемых белков проводился с использованием двух типов ионизации {MALDI и EST) и двух типов детекторов (времяпролетного и типа ионная ловушка). Разработанная схема сопряжения АСМ-биоспецифический фишинг и МС также была успешно апробирована для детекции белковых маркеров вирусного гепатита С (ВГС) (HCVcoreAg и Е2) в образцах сыворотки крови.

Практическая значимость работы .

Результаты данной работы дают возможность создания высокочувствительных протеомных методов без использования меток и дополнительных процедур подготовки образцов для обнаружения белков, находящихся в биологическом материале в низкой концентрации, в том числе в сыворотке крови. Предложен подход на основе атомно-силовой микроскопии и масс-спектрометрии, который позволит выявлять и идентифицировать белковые маркеры вируса гепатита С в сыворотке крови человека.

Подход может быть использован в разработках, направленных на создание новых диагностических чипов, поиск биомаркеров широкого диапазона социально-значимых заболеваний.

Апробация работы.

Основные результаты исследования были представлены на «1-м, 2-м и 3-м Международном форуме по нанотехнологиям» (Москва, 2008-2010); «IV съезде Российского общества биохимиков и молекулярных биологов», Новосибирск, 2008; на Международной конгрессе «Протеом человека», Амстердам, 2008; на Международной конгрессе «Протеом человека», Сидней, 2010.

Публикации.

Структура и объем диссертации.

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов исследования и их обсуждения, заключения, выводов и списка литературы. Работа изложена на 104 страницах, иллюстрирована 33 рисунками и 4 таблицами, список литературы состоит из 159 наименований.

Анализ научно-технического задела в области высокочувствительных протеомных технологий

Одним из приоритетных направлений в современной науке является обнаружение и выяснение роли различных типов белков в организме, а также понимание молекулярных механизмов, приводящих к развитию заболеваний.

Несмотря на постоянное совершенствование протеомных методов, количество вновь открытых биомаркеров заболеваний остается практически / неизменным за последнее десятилетие . Это связано с тем, что концентрационный предел детекции традиционных протеомных методов не превосходит 10"9 М . В то же время важным для протеомики является разработка новых аналитических подходов идентификации белков более низкого концентрационного диапазона, в частности низкокопийных белковых молекул (с концентрацией 10"13 М и менее), в том числе биомаркеров в биологическом материале. Поскольку можно предполагать, что именно в этих концентрационных диапазонах находятся белковые маркеры большинства заболеваний .

Одно из активно развивающихся направлений, позволяющее, несколько повысить концентрационную чувствительность анализа, заключается в создании аналитических комплексов на основе нанохроматографических и наноэлектрофоретических систем, совместимых с масс-спектрометрами.

Нанохроматографическая система в комбинации с масс-спектрометрией и электроспрейным типом ионизации- позволили повысить чувствительность выявления белков на два порядка по сравнению с хроматографией высокого разрешения (ВЭЖХ) . Предел концентрационной чувствительности таких сопряженных систем ограничен чувствительностью стадии электрофореза/хроматографии, и не превосходит 10"12 М для отдельных белков (например, для цитохрома С и брадикинина) .

В настоящее время хроматографические методы развились в отдельные самостоятельные направления - SELDI МС анализ {surface enhanced laser desorption and ionization/time of flight mass spectrometry) , методы фишинга белков с использованием магнитных микрочастиц . В этих технологиях, гидрофобные или заряженные поверхности SELDI-чипов -. или магнитных микрочастиц в, комбинации с масс-спектрометрическим анализом, успешно используются: для? выявления- и идентификации, как отдельных типов; белков, так и для белкового/пептидного профилирования сыворотки крови [в, 8; \Ъ, 15]. SEbDIi МЄ представляет собой: мощный подход, позволяющий исследовать биоматериал за- счет адсорбции биомолекул (белковj. пептидов) на химически активированную? поверхность (катионо-/анионообменные чипы) с последующим масс-спектрометрическим анализом адсорбированных: молекул:. SEEDPМЄ подход применяется; для-белкового- профилирования биоматериала;. а в последнее время: стал использоваться в качестве «диагностики,по протеомным штрих-кодам» [ 17].. Суть такой «штрих-кодовой диагностики» заключается в выявлении? особенностей белкового профиля биологического образца; связанных с определенным заболеванием: Так, известно; что г при. раковых заболеваниях «протеомный штрих-код» бйоматериала- значительно отличается от такого у здоровых1 групп» лиц: Поэтому, контроль над изменением белкового; состава биоматериала может стать основой для раннешдиагностики заболеваний. На; сегодняшний день, с помощью подхода SELDI? МЄ были выявлены маркеры. рака желудка, яичников, простаты, и молочной железы : Ограничение этого метода5 заключается вь невозможности идентифицировать белки с высоким разрешением и достоверностью, что особенно важно при; анализе многокомпонентных смесей, таких как биологическийгматериал.

Помимо проблемы низкой концентрационной чувствительности существующих аналитических систем, камнем преткновения для протеомного анализа биологического материала стал широкий динамический диапазон концентраций белков, особенно в сыворотке крови, который варьирует от 1(Г М вплоть до отдельных белковых молекул. Высококопийные (мажорные) белки препятствуют в таких системах выявлению и идентификации низкокопийные (минорных) белков .

Проблему широкого концентрационного диапазона белков в биоматериале возможно решить путем применения методов обеднения сыворотки крови от мажорных фракций белков, методов сепарации многокомпонентных смесей и нанотехнологических методов, основанных на биоспецифическом и химическом фишинге белковых молекул аналита из сложных смесей на поверхность чипов к различным биосенсорам или на активированную поверхность магнитных микросфер .

Традиционно для разделения многокомпонентных белковых смесей используют одномерный, чаще двумерный гель-электрофорез . Принцип разделения белков методами- двумерного гель-электрофореза основан на различии белков по значениям их изоэлектрических точек Hf молекулярных масс . В протеомике данные подходы применяются для белкового картирования биоматериала (ткань, плазма крови и др.) . Комбинация одномерного и/или двумерного электрофореза с масс-спектрометрией позволяет идентифицировать разделенные и визуализированные белки . Однако процедура двумерного гель-электрофореза до сих пор не автоматизирована, достаточно, сложна и трудоемка в исполнении, требует высокой квалификации оператора, а результаты анализа зачастую плохо воспроизводимы .

Более удобная по сравнению, с двумерным электрофорезом процедура разделения белков - это хроматография высокого разрешения (ВЭЖХ); которая представляет собой автоматизированную процедуру, позволяющую удалять высококопийные белки из сложной смеси с целью последующего выявления низкокопийных белков .

С целью прямой идентификации белков в сложных смесях, хроматографическая колонка может быть соединена с масс-спектрометром. Однако интактные белки практически не поддаются высококачественному разделению с помощью ВЭЖХ, поскольку денатурируют при проведении анализа (из-за низких значений рН среды и высокой- концентрации органических растворителей), а также вследствие низкой точности масс-спектрометрического анализа, поэтому, прямая идентификация большинства интактных белков, особенно с молекулярной массой превышающей 10 кДа, зачастую невозможна. Аналитическую точность измерения можно улучшить путем гидролитического расщепления белков до пептидных фрагментов, молекулярной массой от 700 до 4000 Да с помощью протеаз; таких как трипсин (технология "bottom-up"). Чтобы достигнуть качественного разделения белков в смеси, применяют- комбинацию нескольких хроматографических процедур, так называемая, многомерная хроматография .

Методы диагностики гепатита

В настоящее время для белковой диагностики гепатита С используются тест-системы на выявление анти-HCVcore. Первые ИФА-тесты, детектирующие наличие антител анти-HCVcore, стали доступны в начале 1990-х г., но они обладали низкой чувствительностью и селективностью. Позднее, в конце 90-х гг., появились ИФА-тесты на анти-HCVcore нового поколения, которые обладали достаточно высокой чувствительностью около 95-99% и могли выявлять ВГС спустя несколько месяцев после инфицирования .

Например, в 1996 г. на российском рынке появились тест-системы, разработанные в «Вектор-Бест» (Новосибирск) и «Диагностических системах» (Нижний Новгород) для выявления антител - анти-HCV класса IgM. Роль антител класса IgM в серодиагностике изучена недостаточно, однако некоторыми исследованиями показано значение данного маркера для выявления хронического гепатита С . Установлено также, что корреляция между выявлением РНК вируса и анти-HCV IgM у больных составляет 80-95% . Для определения фазы развития вирусного гепатита С Афанасьев А.Ю. с соавторами использовали коэффициент, отражающий отношение содержания в крови больных анти-HCV IgG к анти-HCV IgM . На сегодняшний день разработано множество систем твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA), которые обнаруживают циркулирующие антитела ко многим эпитопам,вируса гепатита Є.

Современная лабораторная диагностика: вирусного гепатита Є в большинстве лечебных учреждений г.. Москвы, осуществляется; в соответствии с существующими приказами Минздрава РФ и Департамента Здравоохранения: г. Москвы и заключается в определении иммуноглобулинов? класса G к вирусу гепатита Є (анти-HGV IgG) в сыворотке крови больных. Выявление данного маркера позволяет судить, о наличии текущешили перенесенной инфекции.

Недостатки методов;. детекции на основе EEISA, помимо, низкой чувствительности (более ГО"12 M)j обусловлены также ложной- детекцией; вирусного гепатита Є у пациентов- вследствие постинфекционного-иммунитета,., кросс-реактивности антител, а также недостаточной чувствительностью в. период острой) фазы BFG . BI СВЯЗИ? С: ЭТИМ продолжаются активные поиски; чувствительных, специфичных, быстрых и простых в исполнении методов детекции1маркеров «гепатита Є .

Другая- группа методов детекции, вирусного гепатита в сыворотке: крови заключается-ВІрегистрации;РНК ВЕЄ с помощью ПЦР; Определение РНК. BFG методами; ГЩР не может использоваться в качестве первичного теста для - подтверждения или исключения; диагноза; но; может быть; полезен для подтверждения диагноза: Диагностика1 BFG осуществляется посредством анализа 5 -некодируемого участка РНК. Однако результаты анализа варьируют.среди разных генотипов BFG.

На российском рынке появились биологические микрочипы, позволяющие проводить- генотипирование BFG и- определять, эффективную, схему противирусной; терапии. Данный биочип- представляет собой олигонуклеотидныйшикрочип для генотипирования BFG на основе анализа области NS5B. Полученные результаты свидетельствуют о способности биочипа идентифицировать все 6 генотипов и 36 подтипов ВГС, в том числе наиболее вирулентные и лекарственно устойчивые формы.

С одной стороны, методы ПЦР-анализа сверхчувствительны и позволяют детектировать и амплифицировать сигнал всего от одной молекулы РНК в образце, но с другой стороны, для этих методов характерны ложноположительные результаты вследствие случайной контаминации образцов, ложноотрицательные результаты из-за высокой мутируемости вируса и сравнительно высокая стоимость анализа. Даже у одного и того же человека уровень РНК ВГС может периодически изменяться более чем в миллиотраз, приводяк ложноотрицательным результатам, в случае низкой? репликации вируса или если вирус сохраняется в тканях, не попадая в кровь. Результаты количественного определения РІЖ, ВГС в.разных лабораториях недостаточно хорошо согласуются .

Особую ценность для ранней детекции вирусного гепатита С Bt биоматериале представляют белковые антигены ВГС в связи с тем, что появляются1 в сывороткекрови на несколько недель раньше, еще до-развития полноценного иммунного ответа организма.

Поверхностныйантиген HCVcoreAg вируса гепатита С является основным маркером инфицирования- вирусом, гепатита С. Он обнаруживается за 16 недель до появления антител в крови вследствие иммунного ответа организма и до развития клинических признаков, при этом- он регистрируются как в,острую, так и в хроническую фазы заболевания . Существует лишь один зарубежный коммерческий продукт («Ortho Clinical Diagnostics») ИФА-диагностики гепатита С в период острой фазы, основанный, на детекции HCVcoreAg.

Структурный белок HCVcoreAg, состоящий из 121 аминокислотного остатка, расположен на N-конце полипептида и образуется под воздействием клеточных протеаз . Первый протеолитический гидролиз происходит между остатками 191 и 192 (сайт С1) и-приводит к образованию гликопротеина Е1 . Второе место разрезания (С2) находится-между 174 и 191 аминокислотами.. Соответствующие продукты разрезания получили названия р21 и р23 . Анализ экспрессии в ряде клеток млекопитающих показал, что р21 является основным продуктом, а, р23 обнаруживается в минорных количествах. Возможно, что расщепление по сайтам С1 и С2 -взаимосвязанные процессы, поскольку р21 образуется в условиях, когда гидролиза по G2 не наблюдается [Г45]. HCVcoreAg представляет собой основные РНК-связывающий белок, который по-видимому, формирует вирусный нуклеокапсид. Биохимические- свойства этого- белка до сих пор плохо охарактеризованы. Исследования методом- АСМ" вирусных частиц гепатита С позволили получить изображение капсида HCV .

АСМ-чипы

В экспериментальной части работы использовались два типа АСМ-чипов. С помощью первого типа проводилась МС-идентификация модельных белков на поверхности АСМ-чипов. Эти чипы представляли собой подложки с функционально активными химическими группами, (далее называемые АСМ-чипы с химически активированной поверхностью), на которую были выловлены исследуемые молекулы и необратимо иммобилизованы за счет ковалентных связей, так называемая процедура «химического фишинга». Второй- тип АСМ-чипов использовался для МС-идентификации на- их поверхности белков, биоспецифически выловленных из,раствора аналита. На поверхности данных чипов- в- рабочих зонах, предварительно были иммобилизованы биологические зонды. В качестве биологических зондов использовались моноклональные антитела против- маркерных белков вирусных гепатитов В и.С (BFB и BFC) илиаптамерьр против белка gpl20 и тромбина. Для, процедуры биоспецифического-фишинга чипы с ковалентно иммобилизованными молекулами-зондами инкубировались. в% растворе аналита, содержащий только детектируемый белок, либо образцы сыворотки кровш

Для выполнения задачи МС-идентификации модельных белков, ковалентно иммобилизованных на поверхности АСМ-чипов первого типа, в работе были использованы: авидин (Agilent, США), HSA (Agilent, США), Р450 ВМЗ (любезно предоставленный профессором А.В. Мунро, Манчестерский университет, Великобритания), тромбин (Sigma, США), a-FP и анти-a-FP (USBio, США); Для выполнения задачи МС-идентификации белков на поверхности АСМ-чипов второго типа, биоспецифически выловленных из раствора аналита, в качестве молекул-зондов использовались моноклональные антитела (МКА): анти-HCVcore (Virogen, США), анти-HBVcore (НИИ молекулярной диагностики, Москва), анти-HBsAg (Aldevron, США), в качестве молекул-мишени: HBVcoreAg, HCVcoreAg (Virogen, США) и HBsAg (Aldevron, США), gpl20 (Sigma, США), тропонин (USBio, США).

Кроме того, в работе использовались следующие вещества: ацетонитрил, изопропанол, муравьиная кислота, дистиллированная вода (Merck, США), трифторуксусная кислота (ТФУ), бикарбонат аммония (Sigma, США), а-циано-4-гидроксикоричнаЯі кислота (НССА), дигидроксибензойная кислота-(DHB) (Bruker Daltonics, Германия), трипсин (Promega, США).

Образцы сывороток крови для АСМ-исследованияг были предоставлены Кафедрой инфекционных- болезней у детей РГМУ, ЦНИИ эпидемиологии Роспотребнадзора, МНИИЭМ" им. Габричевского: Наличие частиц вируса гепатита С (HCV) в, образцах сывороток крови подтверждалось с помощькь метода полимеразной{цепнойфеакции(ПЦР) с использованием тест-системы "Амплисенс HCV Монитор" (ЦНИИ эпидемиологии МЗ РФ, Москва).

АСМ-анализ проводился в лаборатории нанобиотехнологии ИБМХ РАМН. Подсчет белков и комплексов антиген/антитело- на поверхности АСМ-чипа проводился на- основе соотнесения высот соответствующих изображений белков и их комплексов, измеренных с помощью- АСМ, согласно методике, изложенной в . Был использован» ACM NTEGRA (NT-MDT, Россия). АСМ-измерения проводились в полуконтактношмоде. В качестве зондов использовались кантилеверы фирмы NT-MDT серии NSG10. Типичный радиус кривизны игл составлял 10 нм, резонансная частота лежала в пределах от 190 до 325 кГц. Площадь сканирования чипа составляла 400 мкм2. Каждое измерение проводилось не менее 3 раз.

Иммобилизацию белков и аптамеров на поверхность АСМ-чипа проводили по следующей процедуре.

К белковому раствору (0,1 цМ) объемом 2 мкл добавляли 8 мкл раствора смеси NHS/EDC (v/v=l/l) и тщательно перемешивали. Полученную смесь наносили на поверхность силанизированного-чипа и инкубировали в течение 2 минут при комнатной температуре. Чип затем дважды промывали в термошейкере 1 мл деионизованной воды при 800 rpm и 37С. Качество иммобилизации.белков на поверхности АСМ-чипа контролировалось атомно-силовой микроскопией.

Иммобилизация аптамеров на химически активированную поверхность АЄМ-чипа проводилась следующим образом. К стоковому раствору DSP концентрацией 1,2 мМ в DMSO/этанол (v/v=l/l)4 добавляли раствор буфера PBS 50 мМ (рН 7.4,) также в соотношении 1/1 по объему. Полученный-таким образом рабочий раствор наносили, на поверхность АСМ-чипа и инкубировали в течение 10 минут. После чего проводили отмывку 50%-ным раствором-этанола в, воде объемом 1 мл при 15С в течение 10 минут. Раствор аптамера с концентрацией 3 JIM наносили на активированную зону АСМ-чипа и инкубировали в течение 4 минут и при перемешивании со скоростью 800 об./мин. Блокирование непрореагировавших аминогрупп кросс-линкера DSP осуществлялось в присутствии 5 мМ раствора Tris-HCl в течение 10 минут при 37С Заключительная стадия отмывки проводилась дважды водным раствором объемом 1 мл в течение 10 минут при 25С.

На поверхность АСМ-чипа с иммобилизованными молекулами-зондами наносилась трипсинолитическая смесь, содержащая буферный раствор 150 мМ NH4HCO3, ацетонитрил, 0,5 М гуанидин гидрохлорид, глицерол (рН 7,4). Затем к буферному раствору добавлялось 0,5 мкл раствора свиного модифицированного трипсина с концентрацией 0,1 мкМ. АСМ-чип инкубировался во влажной среде в течение 2 часов при постоянной температуре 45С, на его поверхность снова добавлялось 0,5 мкл раствора трипсина (0,1 мкМ), и инкубация продолжалась еще 12 часов. Трипсинолитическая смесь смывалась с поверхности АСМ-чипа раствором элюции объемом 10 мкл, содержащим 70% ацетонитрил в 0,7% трифторуксусной кислоте (ТФУ). Полученный таким образом с поверхности АСМ-чипа гидролизат высушивался в вакуумном испарителе при 45С и 4200 об./мин. Далее пептидная смесь растворялась в 10 мкл 5% раствора муравьиной кислоты или в 10 мкл 0,7% раствора ТФУ для проведения последующего МС-анализа.

При проведении МС-анализа с МАЛДИ-типом ионизации подготовка образцов осуществлялась следующим образом. Пробы, растворенные в 0,7% растворе ТФУ объемом 10 мкл, концентрировались и обессоливались с использованием микронаконечников ZipTip С18 (Millipore, США) в соответствии с протоколом производителя и смешивались с насыщенным раствором матрицы, содержащей НССА или DHB в 50% растворе ацетонитрила с 0,7% ТФУ. Полученную смесь наносили на МАЛДИ-мишень размера МТР.

-идентификация белков, выловленных с помощью «химического фишинга» на поверхность АСМ-чипа из раствора аналита

На данном этапе экспериментальной работы были получены МС-спектры для модельных белков, химически иммобилизованных на поверхности АСМ-чипов из раствора аналита. Диапазон концентраций исследуемых белков в растворе аналита для авидина, HSA, анти-aFP составлял 10" -10"9 М, тропонина, aFP и Р450 ВМЗ - 10"6-10"8 М.

МС-анализ проводился для 6 типов белков, различных по своему происхождению, молекулярной массе, количеству сайтов трипсинолиза и их пространственной доступности, степени гидрофобности аминокислотной последовательности (соотношение гидрофобных аминокислот к гидрофильным), которые были ковалентно иммобилизованы на поверхности АСМ-чипа из раствора аналита (таблица 1). В, данных экспериментах использовались АСМ-чипы, которые содержали рабочую и контрольную зоны. Рабочая зона являлась химически» активированной областью поверхности АСМ-чипа, на которой происходил «химический фишинг» модельных белков; контрольной зоной являлась химически неактивная область поверхности чипа. Подсчет визуализированных выловленных молекул регистрировали с помощью АСМ. Экспериментальные данные АСМ-анализа, полученные для вышеперечисленных модельных белков, а именно число молекул, выловленных на поверхности рабочей зоны АСМ-чипа, представлены в таблице 2. В колонке «концентрация белковых молекул в растворе» таблицы 2 приведены данные для минимально зарегистрированной концентрации соответствующего- белка в растворе аналита.

Как видно из таблицьг2, число молекул, зарегистрированных в рабочей зоне АСМ-чипа для всех представленных белков, составило -1040 молекул. Предел чувствительности МС-детекторов составляет около 105 молекул. Таким образом, для представленных модельных белков была проведена успешная необратимая иммобилизация на поверхности АСМ-чипа, и количества АСМ-зарегистрированных белковых объектов было достаточно для последующей МС-идентификации. При этом минимально зарегистрированная концентрация модельных белков в инкубационном растворе была при этом достаточно низкой 10" -10" М.

Масс-спектрометрический анализ образцов проводили с использованием МАЛДИ- и ЭСИ-типов ионизации. АСМ-чипа после инкубации в соответствующем растворе авидина с концентрацией 10"9 М. Анализ этих спектров позволил достоверно идентифицировать авидин {Gallus Gallus) по двум его протеотипическим пептидам: SSVNDIGDDWK (m/z=618,6) и VGINIFTR (m/z=460,4). Оба пептида имели хорошо выраженные пики своих двухзарядных ионов (МС-спектры). С помощью АСМ-МС анализа химически активированной рабочей зоны АСМ-чипа после инкубации в растворе белка аналита концентрацией 10"8 М был выявлен другой небольшой белок - тропонин I. Соответствующие пептидному двухзарядному иону 1449 Да МС- и МС/МС-спектры представлены на рисунке 3. МС-анализ экспериментально полученных спектров, позволил достоверно с вероятностью более 95% выявить и идентифицировать тропонин человека (gi 2460249) на поверхности АСМ-чипа.

На рисунке 5 представлены тандемные спектры фрагментации глобулярного белка - сывороточного альбумина человека (HSA), который выполняет в плазме крови транспортные функции. Спектры были получены с химически активированной рабочей зоны АСМ-чипа после инкубации в соответствующем- растворе альбумина с концентрацией 10"9 М. Анализ этих спектров позволил достоверно идентифицировать альбумин человека по двум его протеотипическим пептидам: VPQVSTPTLVEVSR (m/z=756,5) и YLYEIAR (m/z=464,3). Оба пептида имели хорошо выраженные пики своих двузарядных ионов (МС-спектры).

МС/МС спектры трипсинолизованных объектов с химически активированной поверхности АСМ-чипа, инкубированного в растворе сывороточного альбумина человека (С=10 9 М). Пептид VPQVSTPTLVEVSR с m/z=756,5 (А), пептид YLYEIAR с m/z=464,3 (Б). Экспериментальные условия: измерения были проведены на масс-спектрометре LC/MSD Trap ХСТ Ultra (Agilent).

Таким образом, МС-анализ позволил идентифицировать белки, обнаруженные с помощью АСМ. На основании- полученных данных была выявлена зависимость между числом идентифицированных протеотипических пептидов на поверхности АСМ-чипа и содержанием искомого белка в растворе аналита. Такая зависимость, например, для белков Р450 ВМЗ и HSA, ковалентно иммобилизованных на химически активированной поверхности АСМ-чипа, приведена на рисунке 6. Как видно на рисунке 6, чем выше концентрация белка в растворе аналита (-КГ6 М), тем большее число пептидов удается достоверно идентифицировать как в случае МАЛДИ-МС-, так и ЭСИ-МС-анализа. Значительных различий между числом идентифицированных пептидов в диапазоне концентраций 10"6-10"9 М среди анализируемых белков в растворе аналита не наблюдалось.

Зависимости числа идентифицированных пептидов молекул аналита от концентрации белка в инкубационном растворе. (А) - анализ смеси пептидов модельных белков HSA, ВМЗ на масс-спектрометрах с МАЛДИ-типом ионизации Bruker Microflex (Bruker Daltonics, Германия) и Autoflex III (Bruker Daltonics, Германия); (Б) - анализ смеси пептидов модельных белков HSA, ВМЗ на масс-спектрометре с ЭСИ-типом ионизации LC/MSD Trap ХСТ Ultra (Agilent, США).

Полученные результаты позволили заключить, что АСМ-МС (МАЛДИ и ЭСИ) позволяет выявлять и идентифицировать ковалентно выловленные из раствора аналита на поверхности АСМ-чипа белковые молекулы, различные по своим физико-химическим свойствам.

В то же время, в контрольной зоне АСМ-чипа (неактивированной) после его инкубации в растворе аналита, методом АСМ не было зарегистрировано наличия на поверхности чипа объектов, соответствующих по высоте белковым молекулам. МС-анализ также не выявил объектов белковой природы. Таким образом, экспериментально было доказано, что АСМ адекватно регистрирует искомые объекты - белковые молекулы аналита.

Следующим этапом данной работы стала отработка схемы комбинации АСМ-МС для идентификации белков, выловленных из раствора за. счет биоспефических взаимодействий.

Схема проведения, масс-спектрометрического анализа- в случае биоспецифического АСМ-фишинга белков из раствора представлена на рисунке 7. Согласно приведенной схеме сначала проводилась иммобилизация молекул-зондов на поверхность рабочей, области АСМ-чипов, в качестве которых выступала моноклональные1 антитела против белковых маркеров вирусных гепатитов В и С или аптамеры против белков гликопротеина ВИЧ-1 gpl20 и тромбина, при этом поверхность контрольной зоны» не содержала иммобилизованных молекул-зондов. Контроль качества иммобилизации молекул-зондов проводили путем AGM-визуализации. Затем такой чип инкубировали в растворе аналита, содержащий исследуемый белок. После стадии отмывки от неспецифически сорбированных молекул на поверхности чипа, и этапа подготовки образца для последующего масс спектрометрического анализа на поверхности АСМ-чипа проводили МС-анализ АСМ-зарегистрированных белков.

Экспериментальная часть данного раздела подразумевала проведение двух этапов анализа. На первом этапе необходимо было провести МС-идентификацию ковалентно иммобилизованных на АСМ-чипе белковых молекул-зондов, на втором этапе - белков-мишеней, выловленных на соответствующие молекулы-партнеры из раствора или из образцов сыворотки крови за счет биоспецифических взаимодействий. Для этого был проведен МС-анализ ковалентно иммобилизованных на поверхности АСМ-чипов МКА против маркерных белков ВГС и ВГВ: анти-HCVcore и анти-HBVcore. Для МКА против белков анти-HCVcore и анти-HBVcore в настоящей работе впервые были получены тандемные спектры фрагментации и спектры пептидных карт.